牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

摘要

牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)是引起牛结核病的病原体，侵染宿主广泛，可感染多种家畜和野生动物，对人类和动物健康构成巨大危害。溶血磷脂酶是催化溶血磷脂失活的主要途径，被认为在调节生物活性脂质水平中起关键作用。但牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶(LLP)的功能及作用尚不清楚。本实验利用基因重组技术，克隆了LIP基因，成功构建其表达载体pET30a(+)-LIP，诱导其高效表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体，为进一步研究牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶(LIP)的功能及在牛结核分枝杆菌中的作用奠定了基础。实验结果如下：
　　 1.以牛结核分枝杆菌的DNA为模板，通过PCR的方法扩增克隆LIP基因，并进行了核苷酸序列测定。结果表明，核苷酸序列与GenBank上所公布的序列同源性为100％。
　　 2.将所扩增基因克隆于原核表达载体pET30a(+)，将重组表达载体转入宿主菌BL21(DE3)进行诱导表达，表达蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析，结果证明LIP蛋白获得高效表达，表达量占菌体总量的31％，分子量大小为30kD左右；利用割胶回收法对表达蛋白进行纯化，纯化率大于95％。
　　 3.重组LIP蛋白能够与患牛结核病的牛阳性血清发生特异性反应，有望成为牛结核分枝杆菌新的诊断抗原，为进一步研究牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶的功能及在牛结核分枝杆菌中的作用奠定了基础。
　　 4.成功地制备了针对LIP蛋白的特异性多克降抗体，通过间接ELISA检测，该多克隆抗体的最大效价为1∶1600。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词表

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第一章引 言

1.1牛结核病的概述

1.2牛结核诊断的研究进展

1.3溶血磷脂酶简介

1.4研究的目的与意义

第二章牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶基因的克隆及核苷酸序列的测定

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3结果与分析

2.4讨论与小结

第三章牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶基因在原核系统中的表达与纯化

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果与分析

3.4讨论与小结

第四章LIP蛋白多克隆抗体的制备

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3结果与分析

4.4小结

第五章结论

参考文献

致谢

附录

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