MAPK/线粒体凋亡途径在绵羊肺炎支原体致支气管上皮细胞氧化损伤中的作用机制研究

摘要

背景:
　　绵羊肺炎支原体(Mycoplasma.ovipneumoniae，简称MO)是一种可感染绵羊和山羊，引起羊支原体肺炎的病原菌。绵羊肺炎支原体的主要宿主细胞是绵羊支气管上皮细胞，其在感染宿主细胞的过程中会造成宿主细胞损伤;近年来研究发现，绵羊肺炎支原体可以通过自身代谢掠夺养分产生H2O2，导致活性氧(ROS)的积累。线粒体作为细胞呼吸作用的重要细胞器，对ROS较为敏感，ROS的沉积会造成线粒体的损伤，线粒体损伤又可以进一步导致细胞凋亡;并且，ROS还是丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号途径的激活剂，MAPK信号途径的主要作用是将信号从细胞外传至细胞内的各种细胞器。然而，绵羊肺炎支原体产生的ROS是否能诱导宿主细胞发生氧化应激反应，以及其是否经MAPK和/或线粒体凋亡途径造成宿主细胞损伤尚不可知。
　　方法与内容:
　　本研究采用绵羊支气管上皮细胞的气液相界面培养(Air-Liquid Interface，ALI)模型，通过DCFH-DA及JC-1探针装载、WST-8、Western Blot、AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡流式细胞术检测、Tunel原位末端凋亡检测等方法开展了以下研究:1.通过检测绵羊肺炎支原体感染支气管上皮细胞后产生ROS、丙二醛(MDA)、GSH/GSSG的水平，抗氧化物酶活性以及线粒体膜电位变化，以探讨该病原菌是否诱导宿主细胞发生氧化应激反应;2.在绵羊肺炎支原体感染宿主细胞后不同时间，移除培养体系中的病原体，继续培养不同时间，检测细胞中的ROS含量，以探讨导致宿主细胞发生氧化应激的ROS的效应模式;3.用绵羊肺炎支原体感染经ROS清除剂NAC和线粒体靶向抗氧化剂MiTo-TEMPO处理和未处理的宿主细胞，检测细胞中ROS、线粒体膜电位、细胞凋亡以及MAPK和线粒体信号途径中相关蛋白表达量的变化，以探讨该病原菌诱导产生的ROS是否经MAPK/线粒体凋亡途径诱导宿主细胞凋亡;4.用绵羊肺炎支原体感染经ERK抑制剂(PD032590)、JNK抑制剂(SP600125)和P38 MAPK抑制剂(SB203580)处理和未处理的宿主细胞，检测细胞中ROS、线粒体膜电位、细胞凋亡以及线粒体信号途径中相关蛋白表达量的变化，以探讨该病原菌经MAPK途径诱导宿主细胞线粒体损伤的机制。
　　结果:
　　1.绵羊肺炎支原体感染支气管上皮细胞产生ROS，引发氧化应激反应，导致线粒体的损伤，进而诱导细胞凋亡。这一过程伴随着细胞内MDA、GSSG水平的增加和抗氧化蛋白酶CAT、GSS、T-SOD、Mn-SOD表达水平及GSH活性水平的降低。
　　2.绵羊肺炎支原体感染支气管上皮细胞不同时间后，清除培养体系中的病原体后继续培养，细胞中的ROS含量在较长时间保持较高水平。提示，绵羊肺炎支原体的一过性感染对支气管上皮细胞发生的氧化应激反应具有明显的触发效应。
　　3.绵羊肺炎支原体感染产生的ROS激活细胞中ERK、JNK和p38 MAPK信号介导的MAPK信号途径，抑制BCL-2抗凋亡蛋白的表达，进而导致线粒体损伤并释放细胞色素C(Cyt-C)进入细胞质，启动caspases信号级联反应，最终诱导宿主细胞发生凋亡。
　　4.绵羊肺炎支原体感染经线粒体靶向抗氧化剂MiTo-TEMPO预处理的支气管上皮细胞后，宿主细胞中ERK、JNK和P38MAPK信号介导的MAPK信号途径中的MEK、ERK、p90RSK、JNK1/2、AP-1、TAK1、MKK3/6和P38 MAPK等关键蛋白的磷酸化水平显著降低(P＜0.05、P＜0.01)，表明绵羊肺炎支原体诱导支气管上皮细胞产生的ROS对ERK、JNK和P38MAPK信号介导的MAPK信号途径具有正反馈作用。
　　结论:
　　本研究利用绵羊支气管上皮细胞ALI界面培养模型探讨了绵羊肺炎支原体感染支气管上皮细胞过程中诱导宿主细胞凋亡的潜在作用机理。研究结果表明，绵羊肺炎支原体感染诱导宿主细胞产生的ROS通过增加支气管上皮细胞的脂类过氧化物、降低细胞抗氧化物的水平等途径诱发宿主细胞的氧化应激反应，激活宿主细胞的MAPK信号途径，改变BCL-2家族蛋白水平的表达，进而诱导线粒体膜电位改变和Cyt-C释放，从而启动caspases信号级联反应，最终致使被感染的宿主细胞发生凋亡。提示，绵羊肺炎支原体诱导产生的ROS所激活的MAPK信号介导的线粒体凋亡途径可能是绵羊肺炎支原体致支气管上皮细胞氧化损伤的机制之一。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第一章 文献综述

1．1 绵羊肺炎支原体

1．1．1 绵羊肺炎支原体的生物学特征及致病性

1．2 氧化应激

1．2．1 ROS

1．2．2 氧化应激与细胞凋亡

1．3 线粒体凋亡途径

1．3．1 线粒体凋亡途径的组成结构

1．3．2 线粒体凋亡途径介导的细胞凋亡机制

1．3．3 线粒体凋亡途径与氧化应激

1．3．4 线粒体凋亡途径在绵羊肺炎支原体致病机制中的研究进展

1．4 MAPK信号途径

1．4．1 MAPK信号途径的组成结构

1．4．2 MAPK信号途径的作用机制

1．4．3 MAPK信号途径与氧化应激

1．4．4 MAPK信号途径在绵羊肺炎支原体致病机制中的研究进展

1．5 气液相界面(air-liquid interface，ALI)培养系统

1．6 研究目的和意义

第二章 绵羊肺炎支原体诱导支气管上皮细胞氧化应激损伤

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料与试剂

2．1．2 主要仪器

2．1．3 试验设计及技术路线

2．1．4 试验方法

2．1．5 数据分析

2．2 结果与分析

2．2．1 绵羊肺炎支原体诱导支气管上皮细胞的细胞死亡和线粒体损伤

2．2．2 绵羊肺炎支原体诱导支气管上皮细胞产生ROS

2．2．3 绵羊肺炎支原体诱导支气管上皮细胞发生脂质过氧化反应并抑制SOD的活性

2．2．4 绵羊肺炎支原体抑制支气管上皮细胞中CAT和GSS的活性

2．2．5 绵羊肺炎支原体干扰支气管上皮细胞中GSH／GSSG的氧化还原反应

2．3 讨论与小结

第三章 绵羊肺炎支原体感染诱导支气管上皮细胞线粒体途径介导的凋亡

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料和试剂

3．1．2 主要仪器

3．1．3 试验设计及技术路线

3．1．4 试验方法

3．1．5 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 绵羊肺炎支原体诱导产生的ROS诱发支气管上皮细胞线粒体损伤

3．2．2 绵羊肺炎支原体诱导支气管上皮细胞产生的ROS经线粒体途径介导细胞凋亡

3．2．3 绵羊肺炎支原体的一过性感染对支气管上皮细胞发生的氧化应激反应的效应模式

3．3 讨论与小结

第四章 MAPK信号介导绵羊肺炎支原体感染支气管上皮细胞线粒体凋亡途径的机制

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料和试剂

4．1．2 主要仪器

4．1．3 试验设计及技术路线

4．1．4 试验方法

4．1．5 数据分析

4．2 结果与分析

4．2．1 MAPKs参与绵羊肺炎支原体诱导的支气管上皮细胞线粒体损伤并介导细胞凋亡

4．2．2 MAPKs经线粒体途径参与绵羊肺炎支原体诱导的支气管上皮细胞凋亡

4．2．3 绵羊肺炎支原体诱导产生的ROS对MAPK信号途径的反馈调节机制

4．3 讨论与小结

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简介