Penicillium melinii 3.4474对芍药苷和芍药内酯苷酯键水解反应的初步研究

摘要

天然产物的结构比较复杂，利用化学方法来进行结构修饰存在着产率低、反应专一性差、副产物多等缺点。而生物转化方法具有反应条件温和、环境友好、高效率和高选择性的特点。因此，生物转化在以天然活性成分为基础的创新药物研究与开发中具有重要的意义。羧酸酯水解酶作为一种重要的生物催化剂，己成功应用在不对称合成、手性化合物拆分等领域，因此在生物转化研究中具有重要的意义。 本文通过二级发酵法，采用TLC分析方法，从15株霉菌中筛选到一株丝状真菌Penicillium melinii3.4474能够转化白芍双苷。通过光谱数据分析确定转化产物为去苯芍药苷(DBP)和去苯芍药内酯苷(DBA)，发生的反应为酯键水解反应。 采用HPLC分析技术，考察了Penicillium melinii3.4474静息细胞和生长细胞转化芍药苷的动态曲线及不同碳源对生长细胞转化芍药苷作用的影响。得出结论蔗糖对Penicillium melinii3.4474酯酶的产生起阻遏作用。确定3.4474静息细胞转化的最佳初始pH为5-6，芍药苷的最适浓度为1.5mg/mL。芍药内酯苷的最适浓度为0.5mg/mL。 采用HPLC分析技术，对Penicillium melinii3.4474产酶条件、酶学特征、稳定性及影响酶活的因素进行了研究：确定该酯酶是存在于胞浆内的一种可溶性诱导酶。酶反应体系的最佳条件： 0.2mol/L Na2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)、温度为42℃。单位体积的粗酶液转化芍药苷的最适浓度为2.0mg/mL，同样条件下芍药内酯苷的最适浓度为0.8 mg/mL。该酯酶热稳定性较差。 最后，考察了底物诱导对Penicillium melinii3.4474产酯酶活力的影响，推测芍药苷是该酯酶的最适底物，也是诱导其产生的最佳诱导物。从SDS-PAGE上追踪到-蛋白条带，推测是Penicillium melinii3.4474产生的酯酶的蛋白条带，分子量约为37KDa。

目录

声明

第一章前言

1.1芍药中单萜类化学成分

1.2芍药苷及芍药内酯苷的生物学活性

1.3生物转化

1.4羧酸酯酶

1.5立题背景和意义

第二章转化白芍双苷微生物的筛选

2.1实验材料

2.2实验方法

2.2.1菌株筛选实验

2.2.2芍药苷转化产物的制备

2.2.3芍药内酯苷转化产物的制备

2.2.4样品分析方法

2.3结果与讨论

2.3.1菌株筛选实验

2.3.2转化产物的结构鉴定

2.4小结：

第三章Penicillium melinii 3.4474静息细胞与生长细胞转化白芍双苷的比较

3.1实验材料

3.2实验方法

3.2.1芍药苷和芍药内酯苷及其转化产物标准曲线的绘制

3.2.2菌丝体的制备

3.2.3生长细胞及静息细胞转化芍药苷的动态曲线的绘制

3.2.5不同碳源对生长细胞转化芍药苷作用的比较

3.2.6初始pH对静息细胞转化作用的影响

3.2.7静息细胞转化芍药苷和芍药内酯苷的最适浓度的考察

3.2.8样品分析方法

3.3结果与讨论

3.3.1静息细胞和生长细胞转化芍药苷的动态曲线

3.3.2不同碳源对生长细胞转化芍药苷作用的影响

3.3.3初始pH对静息细胞转化作用的影响

3.3.4静息细胞转化芍药苷和芍药内酯苷的最适浓度的考察

3.4小结

第四章Penicillium melinii 3.4474产酯酶酶学性质的研究

4.1实验材料

4.2实验方法

4.2.1静息细胞培养液转化芍药苷的考察

4.2.2粗酶液的制备及酯酶活力的检测

4.2.3水解芍药苷酯酶的诱导产生

4.2.4 pH值对粗酶液中酯酶活性的影响

4.2.5温度对粗酶液中酯酶活性的影响

4.2.6粗酶液与底物配比量的考察

4.2.7粗酶液中酯酶的热稳定性

4.2.8 pH值对粗酶液中酯酶稳定性的影响

4.3结果与讨论

4.3.1白芍双苷水解酶的细胞定位

4.3.2粗酶液的制备及酯酶活力的检测

4.3.3水解芍药苷酯酶的诱导合成

4.3.4 pH值对粗酶液中酯酶活性的影响

4.3.5温度对粗酶液中酯酶活性的影响

4.3.6粗酶液转化芍药苷和芍药内酯苷的最适底物浓度

4.3.7粗酶液中酯酶的热稳定性

4.3.8 pH值对粗酶液中酯酶稳定性的影响

4.4 小结

第五章底物诱导对Penicillium melinii 3.4474产酯酶活性的影响

5.1实验材料

5.2实验方法

5.2.1不同底物诱导对菌株3.4474产酯酶活性的影响

5.2.2 SDS-PAGE法[29]比较不同底物诱导的粗酶液

5.2.3水解芍药苷酶转化苯甲酸环己醇酯的研究

5.3结果与讨论

5.3.1不同底物诱导对3.4474菌株产酯酶活性影响的比较

5.3.2 SDS-PAGE法比较不同底物诱导的粗酶液

5.3.3芍药苷水解酶转化苯甲酸环己醇酯

5.4小结

结论

附图

参考文献

参与工作

致谢