产PHA和polyP细菌的筛选及一株芽孢杆菌利用乳品厂废水生成PHB的研究

摘要

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)是一种在众多的原核微生物中都有发现的胞内聚集物，通常当环境中的碳源充足而其它营养物质相对缺乏的情况下可以产生。PHA具有生物相容性和一些传统塑料的性质，是一种生物可降解材料，近年来逐渐成为新型聚合高分子材料相关研究领域的热点。目前生产PHA的主要方法是利用微生物发酵生产，但其成本很高，这阻碍了PHA的广泛使用。筛选高产菌种和寻求廉价发酵原料是解决这一问题的主要途径。聚磷微生物（Phosphorus accumulating organisms，PAOs）是一类可以过量的从外界吸收超出自身生理需要量的可溶性磷酸盐、形成多聚磷酸盐(Inorganicpolyphosphate，polyP)的微生物。其可降低环境中磷含量、起到治理水体富营养化作用。水生生态系统是产PHA和polyP细菌的重要来源。而内蒙古高原湖泊众多，但是目前对其中产PHA和polyP的相关研究尚还很缺乏。
　　本研究利用纯培养方法，从内蒙古高原五个湖泊中采集水样分离细菌，以尼罗蓝染色PHA和DAPI染色polyP的方法筛选产PHA菌和聚磷菌，并对其中一株高产PHA菌50-47（Bacillus endophyticus）进行了产PHA发酵条件优化和胞内PHA定性检测。研究结果表明:分离纯化获得了288株细菌，其中23株产PHA，28株产polyP，12株既能合成polyp又能积累PHA。产PHA菌中有7株合成能力较强，聚磷菌中有10株合成能力较强。基于16S rDNA序列比对的初步分类鉴定表明，23株产PHA细菌中，属于α-蛋白菌纲的有16株，属于芽孢杆菌纲的有6株，还有1株属于放线菌纲;28株有聚磷能力的细菌中，有9株分属α-变形菌纲，8株分属放线菌纲，6株分属芽孢杆菌纲，3株分属γ-变形菌纲，还有2株分属异常球菌纲。定性分析表明，菌株50-47所产PHA为聚-β-羟基丁酸(PHB);1/2R2A培养基培养下，其胞内PHB提取最佳时间为48h;而以乳品厂废水培养下，该菌株可以大量合成PHB，且废水的COD在培养36h后降低了39.5％。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 石油化工塑料及其危害概述

1．2 生物可降解材料

1．3 聚羟基脂肪酸脂(PHA)

1．4 聚-β-羟基丁酸(PHB)

1．4．1 聚-β-羟基丁酸(PHB)的组成和特性

1．4．2 PHB的生产途径

1．4．3 PHB的提取方法

1．4．4 PHB的定量定性分析方法

1．5 多聚磷酸盐(polyP)

1．6 聚磷菌(PAOs)研究介绍

1．7 水体磷污染及微生物除磷

1．8 乳品厂废水及其处理与利用

1．9 本文研究内容、目的及意义

2 材料与方法

2．1 仪器与设备

2．2 试剂和溶液

2．3 培养基及酸化甲醇配方

2．4 引物

2．5 软件名称和网站用途

2．6 样品采集

2．7 样品水质检测

2．7．1 温度、盐度、pH

2．7．2 总氨测定

2．7．3 总磷的测定

2．8 细菌的分离和培养

2．9 菌株的分子鉴定

2．9．1 PCR扩增体系

2．10 产PHA和polyP菌株的筛选

2．11 菌株50-47合成PHA研究

2．11．1 菌株50-47培养条件的优化

2．11．2 菌株50-47内PHA合成动态图像观察

2．11．3 菌株50-47胞内PHA的提取及定性检测

2．12 乳品厂废水培养菌株50-47产PHA的初步分析

2．12．1 废水培养菌株动态图

2．12．2 废水COD去除分析

3 结果分析

3．1 采样情况及参数

3．2 菌株分离纯化

3．2．1 基于16s rRNA基因的分类和系统发育分析

3．2．2 产PHA菌株的筛选

3．2．3 胞内物polyP染色筛选结果

3．3 菌株50-47培养条件优化

3．3．1 温度优化

3．3．2 pH优化

3．3．3 盐度优化

3．3．4 50-47的最适生长情况

3．4 菌株50-47合成PHA动态

3．5 菌株50-47内部PHA的提取及定性检测结果

3．5．1 PHA的提取

3．5．2 PHA定性检测

3．6 乳品厂废水培养菌株50-47产PHA的初步分析

3．6．1 废水培养50-47合成PHA动态

3．6．2 废水COD去除分析

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

作者简介