Cu/Zn-SOD提取条件优化及层层自组装法制备PAH/PSS微囊的研究

摘要

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，简称SOD）广泛存在于动物、植物及藻类等生物体内，本文以牛血为实验原材料，进行了牛血Cu/Zn-SOD最佳提取条件的优化，然后采用层层自组装技术制备了包裹有铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)的聚电解质微囊，最后将包裹有铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)的聚电解质微囊进行了胰蛋白酶水解实验。结果如下：
　　⑴研究了Cu2+浓度、Zn2+浓度、热变性温度和热变性时间4种单因素分别对牛血中Cu/Zn-SOD活性的影响。以4种单因素为基础设计了4因素5水平正交试验，通过邻苯三酚法测定了Cu/Zn-SOD活性，考马斯亮蓝法测定了Cu/Zn-SOD含量，聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了蛋白纯度，确定了牛血Cu/Zn-SOD的最佳提取条件。结果表明:当Cu2+、Zn2+分别为6 mmol/L和12 mmol/L条件下，90℃热变性35 min，最终提取的Cu/Zn-SOD活性为4.14×103 U/mL，比活力为6.74×104U/mg。
　　⑵采用了层-层自组装技术制备了包含超氧化物歧化酶(SOD)的聚电解质微囊，以无定形态碳酸钙颗粒为模板，采用共沉淀原理，将SOD吸附到碳酸钙颗粒中。在碳酸钙表面组装聚苯乙烯磺酸钠[poly(sodium styrene sulfonate)，PSS]和聚烯丙基胺盐酸盐[poly(allyamine hydrochloride)，PAH]，得到以碳酸钙颗粒为母核，PSS/PAH为壳的核壳结构的颗粒。用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶解碳酸钙，然后加入0.2M的Cu2+、0.2M的Zn2+，从而恢复SOD活性，得到了包含SOD的聚电解质微囊。
　　⑶将包裹了聚电解质微囊的SOD与天然SOD进行胰蛋白酶水解试验，结果为包裹前的SOD活性为3.02×103U/mL，其蛋白含量为0.059 mg/mL，比活力为5.14×104U/mg，包裹后SOD活性为2.61×103 U/mL，蛋白含量为0.047 mg/mL，比包裹前的蛋白质含量减少0.012 mg/mL，即包裹率为79.41％，比活力为5.60×104 U/mg，经胰蛋白酶水解4h后，包裹了聚电解质微囊的SOD在240min时，活性为1.99×103U/mL，相对比活力为75.53％，而天然SOD活性为8.65×102U/mL，相对比活力为28.71％，证明将SOD用聚电解质微囊微囊包后对SOD的活性起到了一定保护作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 超氧化物歧化酶简介

1．1．1 超氧化物歧化酶的研究现状

1．1．2 SOD展望

1．2 层层自组装技术简介

1．2．1 层层自组装技术的研究现状

1．2．2 底物碳酸钙纳米颗粒制备研究现状

1．2．3 LBL自组装的方式

1．2．4 LBL制备聚电解质微囊的应用

1．3 研究包裹SOD的目的及意义

1．4 研究内容

1．5 技术路线

2 材料与方法

2．1 材料

2．2．1 主要仪器

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要试剂配制方法

2．2 方法

2．2．1 溶血液的制备

2．2．2 粗酶液的制备

2．2．3 热变性除杂蛋白及最佳热变条件研究

2．2．4 丙酮沉淀

2．2．5 透析处理及冷冻干燥

2．2．6 PAGE电泳检测

2．2．7 SOD蛋白含量测定

2．2．8 SOD活力及比活力测定

2．2．9 SOD活力回收率的测定

2．2．10 聚电解质包裹Cu／Zn-SOD

2．2．11 包裹有聚电解质微囊的Cu／Zn-SOD抗胰蛋白酶水解能力的研究

3 结果与分析

3．1 标准曲线的绘制

3．2 Cu2+、Zn2+浓度与SOD活性关系及相关性分析

3．3 热变性温度对SOD活性及比活力的影响

3．4 热变性时间对SOD活性及比活力的影响

3．5 正交试验结果及结果分析

3．6 PAGE电泳结果

3．7 活力回收率

3．8 聚电解质包裹SOD结果分析

3．8．1 碳酸钙纳米颗粒制备及直径测量

3．8．2 电位图

3．8．3 无定型碳酸钙纳米颗粒

3．8．4 碳酸钙纳米颗粒与绿色量子点链接

3．8．5 聚电解质与红色量子点的链接

3．8．6 包裹有碳酸钙的聚电解质微囊

3．8．7 包裹Cu／Zn-SOD的聚电解质微囊制备

3．9 包裹聚电解质微囊的Cu／Zn-SOD包裹率及抗胰蛋白酶水解能力研究

4 结论与讨论

4．1 结论

4．2 讨论

致谢

参考文献

作者简介