内蒙古猪病毒性腹泻流行病学调查及猪流行性腹泻病毒M、S基因序列分析

摘要

猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PoRV）是目前造成猪病毒性腹泻的三种主要病原，且在临床症状、病理变化以及流行病学上极为相似。传统检测方法虽能对三者进行鉴别诊断，但因操作复杂、检测周期长、灵敏度低等缺点而在实践中并不常用。本试验针对三种病毒的保守序列分别设计特异性引物，并在明确各病毒单项RT-PCR最优反应条件的前提下，逐步优化多重RT-PCR反应条件，最终建立了可同时检测上述三种病毒的多重RT-PCR检测方法。特异性、灵敏性及一致性试验结果表明，多重RT-PCR方法特异性强，灵敏度高，与常规RT-PCR方法的整体符合率为97.5％，适用于三种病毒的鉴别诊断和流行病学调查。
　　应用已建立的多重RT-PCR方法，对2013～2015年间内蒙古9个盟市的413份腹泻样品和115份无腹泻症状样品进行PEDV、TGEV、PoRV三种病原的检测。结果显示，受检的413份腹泻病料中有260份呈现PEDV阳性，阳性率为62.95%；未发现TGEV感染病例；PoRV仅于个别猪场与PEDV混合感染，阳性率为1.94%。在未发生腹泻的猪群中同样存在PEDV感染，阳性率为41.74%，未发现TGEV感染，仅发现一例PoRV感染猪只。不同日龄猪群均存在PEDV感染，以哺乳仔猪阳性率最高，达72.03%；其次是母猪。此外，不同类型样品的病原检出率有所差异，肠道样品中PEDV检出率最高，达87.50%，其次是肛门拭子，粪便中PEDV阳性率最低，为52.50%。检测结果表明，PEDV是引起内蒙古地区猪群病毒性腹泻的主要病原，并主要危害哺乳仔猪。
　　对各盟市PEDV检测为阳性的病料进行M、S基因的克隆、测序，并与国内外已报道的57条基因序列进行比对和遗传进化分析。同源性及遗传进化分析结果表明，CH/NMG/HLBE株、CH/NMG/BYNE株、CH/NMG/CF株和CH/NMG/EEDS株、CH/NMG/BT株、CH/NMG/HHHT株同源性较高，并与近年来流行的“亚美型”毒株亲缘关系较近，同位于G1分支上；CH/NMG/WLCB株和CH/NMG/XLGL株与疫苗株Vaccine CV777同源性较高，同位于G3分支上；CH/NMG/TL株则与吉林CH/JLGZ/2011株亲缘关系最为密切，同位于G2分支。核苷酸及氨基酸序列比对结果表明，PEDV的M基因较为保守，但其S基因变异明显，且主要集中于S1区的N’端。

目录

声明

缩 略 语 表

第一章 引言

1 猪流行性腹泻

1.1 猪流行性腹泻流行病学研究进展

1.2 猪流行性腹泻检测方法的研究

1.3 猪流行性腹泻病毒分子生物学特性

2.1 猪传染性胃肠炎流行病学研究进展

2.2 猪传染性胃肠炎检测方法的研究

2.3 猪传染性胃肠炎病毒分子生物学特性

3 猪轮状病毒

3.1 猪轮状病毒病流行病学研究进展

3.2 猪轮状病毒检测方法的研究

3.3 猪轮状病毒分子生物学特性

4 研究目的及意义

第二章 PEDV、TGEV、PoRV多重RT-PCR检测方法的构建

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.1 单项RT-PCR最佳退火温度试验结果

2.2 单项 RT-PCR最佳引物浓度及敏感性鉴定结果

2.3 单项RT-PCR特异性试验结果

2.4 多重RT-PCR最佳退火温度试验结果

2.5 多重RT-PCR最佳引物浓度试验结果

2.6 多重RT-PCR特异性试验结果

2.7 多重RT-PCR敏感性试验结果

2.8 多重RT-PCR反应体系构建结果

2.9 多重RT-PCR与单项RT-PCR一致性检测结果

3 讨论

第三章 内蒙古地区猪病毒性腹泻流行病学调查

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 PEDV、TGEV和PoRV流行病学调查结果

2.2 各盟市腹泻样品检测结果

2.3 不同猪群腹泻样品检测结果

2.4 不同类型样品的检测结果

2.5 PED区域性流行规律

3 讨论

第四章 猪流行性腹泻病毒M基因和S基因的遗传进化分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.1 病料RT-PCR检测结果

2.2 重组质粒PCR检测结果

2.3 M基因遗传进化树分析结果

2.4 M基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分析结果

2.5 M基因核苷酸及其推导氨基酸序列比对结果

2.6 S基因遗传进化树分析结果

2.7 S基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分析结果

2.8 S基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列比对结果

3 讨论

结论

致谢

参考文献

作 者 简 介