正常受精、克隆与转基因牛的成纤维细胞microRNA表达谱分析

摘要

机体维持正常的生理机能和健康，需要控制体内代谢平衡。一些重要的转录因子可以直接或间接的影响营养和代谢链，如胆固醇、脂质、葡萄糖和胰岛素等可以快速改变基因表达的程序，从而维持代谢平衡。microRNAs（miRNAs）可以调控动物多种生理生化活动，在基因表达的转录水平或转录后水平表现为重要的调控分子，miRNAs可能也参与调控体细胞克隆动物和转基因克隆动物的表观遗传。
　　利用Solexa测序技术，分别检测并分析2头体内受精(in vivofertilization，Ferti)牛、2头克隆牛(somatic cell nuclear transfer，SCNT)和2头转fat-1基因牛（transgenic，TG）的成纤维细胞中的miRNA表达谱，共建立了6个miRNAs文库。利用Mireap软件，分析miRNA的表达差异，探讨成纤维细胞中miRNAs的表达规律，并预测了差异miRNAs调控的靶基因。通过基因GO(Gene ontology)数据库富集分析和全基因组及代谢途径数据库(KEGG)通路分析，研究了这些靶基因参与的生物学通路，初步揭示了体内受精、克隆和转基因来源的牛中的miRNA表达和靶向基因之间的关系。
　　结果表明:
　　1.运用miRNAs测序技术，共检测了367个已知miRNAs，其中83个、19个和23个已知miRNAs分别在体内受精、克隆和转fat-1基因牛中特异性表达，14个已知miRNAs在三者中共同表达;新发现了178个数据库未公布的miRNAs，其中17个、1个和4个新的候选miRNAs分别在体内受精、克隆和转fat-1基因牛中特异性表达，1个新的候选miRNA在三者中共同表达。
　　2.通过筛选体内受精、克隆和转fat-1基因牛成纤维细胞中的差异表达miRNA，发现成纤维细胞中存在一系列上调和下调的miRNA。通过Real time RT-PCR方法检测、验证和比较体内受精、克隆和转基因组三组中表达量前10个miRNA的差异，同时对表达量高的2个新的候选miRNA进行荧光定量PCR验证，并预测部分高表达的候选miRNA结构。GO富集分析和KEGG通路分析显示，差异表达miRNA对应靶基因显著富集的通路主要在代谢通路、MAPK信号通路、钙离子信号通路、嘌呤代谢通路、泛素介导的蛋白水解通路、嘧啶代谢通路和细胞周期通路等7个生物学通路。
　　3.通过生物信息学软件预测FGF10、LPL和ATGL可能作为bta-miR-21的靶基因，荧光定量PCR验证后发现，与克隆牛和转基因牛成纤维细胞相比，FGF10和ATGL的mRNA在体内受精牛成纤维细胞中表达显著降低，而bta-miR-21在体内受精牛成纤维细胞中表达显著升高，初步认为bta-miR-21与FGF10和ATGL的表达存在负调控的关系。
　　4.microRNA的功能鉴定。利用在体外水平过表达或敲减bta-miR-21，检测靶基因的表达变化，进一步证明bta-miR-21与FGF10和ATGL的靶向关系，bta-miR-21可能通过调控FGF10和ATGL的表达发挥作用。
　　结论:
　　1.本研究建立了遗传背景一致，不同来源胚胎（体内受精、克隆和转fat-1基因牛）成纤维细胞的miRNA文库，获得了可能影响克隆、转基因克隆后代发育的miRNA信息，为深入揭示克隆与转基因克隆胚胎发育异常的机制提供了重要参考。
　　2.本研究发现bta-miR-21及其靶基因FGF10和ATGL在体内受精、克隆和转fat-1基因牛胎儿成纤维细胞中具有调控作用，推测bta-miR-21及其靶基因FGF10和ATGL可能是克隆与转基因克隆胚胎发育调控的重要靶标。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述 克隆与转基因克隆相关技术研究进展

1．1 克隆与转基因克隆动物研究进展

1．1．1 动物克隆技术

1．1．2 动物转基因(transgenic)技术

1．2 克隆与转基因克隆动物研究中遇到的问题

1．2．1 克隆效率低

1．2．2 胎盘肥大且功能异常

1．2．3 克隆相关基因的异常表达

1．2．4 转基因克隆动物存在的问题

1．3 克隆与转基因动物机理研究进展

1．4 miRNA在动物发育调控中的作用

1．4．1 在动物正常发育中的作用

1．4．2 在克隆动物中的研究情况

1．4．3 在转基因动物研究中的情况

第二章 体内受精牛、克隆牛与转fat-1基因牛的成纤维细胞中差异miRNA的筛选

摘要

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 Bta-miR-21和候选靶基因在体内受精、克隆和转fat-1基因牛成纤维细胞表达

摘要

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 Bta-miR-21与FGF10、ATGL靶向关系的验证

摘要

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文