猪组蛋白及其变体表达载体的构建及对猪体细胞重编程的影响

摘要

蛋白翻译后修饰调控信号转导、酶活性、蛋白质定位、识别和降解等过程。组蛋白翻译后修饰不仅可以调控DNA与蛋白的结合水平，影响DNA复制和转录，还可调控染色质结构的转变。组蛋白变体是在组蛋白翻译后进修饰的产物，广泛存在于各种细胞之中。由Hist1h2aa和Hist1h2ba编码的TH2A和TH2B是组蛋白H2A和H2B的生殖细胞特异性变体，在哺乳动物精子发生及卵子发生过程中表达，研究表明TH2A和TH2B在受精后有助于父系基因的激活，而且可提升胚胎重编程效率。本实验在构建猪组蛋白H2A/H2B及其变体TH2A和TH2B表达载体的基础上，初步探索了过表达猪组蛋白及其变体蛋白的不同组合对猪胎儿成纤维细胞诱导重编程的影响。
　　首先提取猪卵母细胞总RNA，反转录获得cDNA，使用PCR扩增目的基因H2a、H2b、Th2a和Th2b基因编码区全长。将目的基因连接到pGEM-T载体上，进行测序鉴定。挑选正确的H2a、H2b、Th2a和Th2b基因，分别连接到pEGFP-N2和pCMV-Red载体上构建表达载体。
　　通过电击转染的方法，将不同表达载体的组合转染至猪胎儿成纤维细胞中，观察细胞荧光表达情况后，G418筛选阳性细胞，采用诱导培养液对胎儿成纤维细胞进行重编程诱导，探索过表达组蛋白及其变体对猪胎儿成纤维细胞诱导重编程关键机制的作用，筛选最佳组合。
　　最后，通过细胞形态以及特异性标记基因表达水平的变化，初步判定猪组蛋白变体Th2a和Th2b组合过表达对猪胎儿成纤维细胞诱导过程中的间质上皮转化具有促进作用。
　　本研究成功构建了猪组蛋白H2A/H2B及其变体TH2A/TH2B表达载体，并成功转染至猪胎儿成纤维细胞中，发现组蛋白变体可促进猪胎儿成纤维细胞重编程，为后续猪诱导多能干细胞的研究奠定了基础。

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