与大鼠CRISP2相互作用蛋白的初步筛选

摘要

有性生殖是自然界中非常重要的一种繁殖方式，主要存在于哺乳类动物中。雄性动物产生的精子与雌性动物产生的卵细胞两者结合到一起形成受精卵，然后受精卵发育成为新的个体。在精子与卵子融合的过程中，涉及到许多蛋白质分子之间的相互作用，特别是膜蛋白之间的相互识别，对于精卵融合有着十分重要的意义。迄今为止，尽管在精子和卵子之间已经鉴定出至少三对相互作用蛋白，但只有精子表面蛋白IZUMO1与卵子表面蛋白JUNO之间的相互作用是精卵融合所必需的。此外，还有一种精子表面蛋白对精卵融合有着重要影响，那就是CRISP2—一种富含半胱氨酸的分泌蛋白，敲除crisp2基因会显著抑制精子与正常卵子融合的效率。CRISP2蛋白本身就能与卵子表面结合，说明卵子上也有CRISP2的受体，但位于卵子表面且能与CRISP2结合的蛋白一直未被鉴定出来。
　　本实验通过构建酵母双杂交诱饵重组载体pGBK-crisp2，从实验室保存的大鼠卵巢cDNA文库中筛选与CRISP2相互作用的蛋白，以期找到能与CRISP2结合的卵子蛋白。实验一共筛选到三个cDNA：creb3l1，tl0aea56yl02和chromosome20，其中只有creb3l1属于已知基因，剩余的两个结果并不属于完整的基因，只是一些RNA或者DNA片段。下一步即可验证CREB3L1蛋白是否位于卵子表面，能否与CRISP2结合。
　　为了鉴定CRISP2蛋白与CREB3L1其在卵子表面上的受体共定位，本实验克隆了大鼠crisp2的cDNA，构建了pGEX-crisp2原核表达重组载体，在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达了CRISP2-GST重组融合蛋白。以此重组蛋白免疫昆明白雌性小鼠，获得了小鼠抗大鼠CRISP2-GST重组蛋白多克隆抗体，将利用该抗体检测CREB3L1卵子上的定位和与CRISP2蛋白结合的细节。

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