基质金属蛋白酶（MT1-MMP/MMP-2）及其组织抑制剂（TIMP-2）在人乳腺癌组织中表达的研究

摘要

目的:乳腺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率有逐年上升趋势，研究和探讨乳腺癌的侵袭和转移机制成为目前研究的热点。众多研究发现，肿瘤的浸润和转移是一个多步骤的复杂过程，其中肿瘤周围基底膜的降解是肿瘤细胞向邻近结缔组织浸润进而向远处转移过程中最基本的一步，基底膜完整性的丧失与局部扩散，远处转移和不良预后密切相关。而由肿瘤组织分泌的基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)能够引起细胞外基质和基底膜的降解，从而促进肿瘤的侵袭和转移，同时其抑制因子可以抑制基质金属蛋白酶的活性，从而保持基底膜的完整性，阻止肿瘤的侵袭和转移。目前，国内对基质金属蛋白酶及其抑制剂在乳腺癌中的表达的情况和临床意义以及它们生物学作用研究较少。因此，本课题利用免疫组化(IHC)和蛋白印迹(WB)两种实验方法在蛋白水平上研究MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP在乳腺癌中的表达特点及与乳腺癌的临床病理因子之间相互关系，以探讨三者在乳腺癌的侵袭和转移机制中的作用，并可为基质金属蛋白酶抑制剂在乳腺癌治疗中的应用提供理论依据。 方法:选取2004年5月至2004年12月在中国医科大学附属第一医院肿瘤外科行手术治疗的64例乳腺癌患者的肿瘤组织标本(一部分以10％的福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成实验标本蜡块备用)，同时收集30例乳腺良性肿瘤组织标本，所有标本均于离体半小时内采集，液氮速冻，后转至-80℃冰箱贮存待用，所有标本均经病理证实，首先应用免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)的实验方法，检测事先制备好的64例乳腺癌组织标本中MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP的表达情况，对于34例共同阳性表达的标本应用免疫组化图像分析软件进行计量分析，然后采用蛋白印迹(WesternBlot)的实验方法分别检测30例乳腺癌组织和30例乳腺良性肿瘤组织中MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP的表达情况，结果分析以电泳条带上各产物的面积与灰度值的乘积作为积分光密度值，作为乳腺癌中各产物的表达水平的参数。应用SAS6.12(StatisticalAnalysisSystemVersion6.12)统计分析软件对实验数据进行统计分析。首先根据实验目的和实验数据类型，明确统计分析方法，采用基础数据的统计描述(StatisticsDelineation)，正态性检验(TestofNormality)，数据转换(DataTransformation)，T检验(Ttest)和单因素方差分析(AnalysisofVariance)等统计分析方法，编写SAS代码，完成统计分析的自动化，显著检验水准α值取0.05。 结果:应用免疫组组织化学的实验方法检测到MMP-2，TIMP-9和MT1-MMP在64例乳腺癌组织中共同阳性表达的为34例，图形分析系统分析分别得出具体表达值分别为：3.11±0.74，2.86±0.65，3.06±0.88(数据经过自然对数转换)。阳性表达主要定位于癌细胞质内，呈棕色颗粒状弥散分布，细胞核阴性，间质细胞表达少。乳腺癌组织中MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2的表达以乳腺癌临床病理因子(T分期，N分期，TNM分期，ER，PR和C-erbB-2)分组分层后分析各组各层间是否存在差异，本实验回答是否定的，即各组间无明显差异，无统计学意义。应用蛋白印迹的实验方法检测到MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2蛋白在30例乳腺癌及良性乳腺肿瘤组织中均有表达，在乳腺癌组织及良性乳腺肿瘤组织中MT1-MMP蛋白的表达水平分别为90.50±27.71，23.70±9.35(t=-12.51，P＜0.001)；MMP-2蛋白的表达水平分别为140.23±+46.82，47.30±16.03(t=-9.35，P＜0.001)；TIMP-2蛋白的表达水平分别为67.57±37.10，10.40±7.44(t=-9.30，P＜0.001)，MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2分别在乳腺良恶性肿瘤组织中的表达存在着极显著的差异。本研究也试图探讨在乳腺癌组织中，MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2三者之间蛋白表达的相关性，但由于样本量较小，不支持相关性分析，所以未能得出三者之间的相关性结论。本研究又通过采用蛋白印迹(WesternBlot)的方法，来观察乳腺癌组织中MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2的表达以乳腺癌临床病理因子(T分期，N分期，TNM分期，ER，PR和C-cerbB-2)分组分层后分析各组各层间是否存在差异，本实验回答是否定的，即各组各层间无显著性差异。但是，经过数据转换后采用各组间T检验进行统计分析，在TNM分期Ⅱ、Ⅲ期之间MMP-2蛋白表达分别为：160.38±47.16，124.80±27.93(t=2.25，P=0.0356)；TIMP-2蛋白表达分别为：53.38±17.02，80.40±38.49(t=-2.27，P=0.0338)，即MMP-2和TIMP-2蛋白表达分别在TNM分期Ⅱ、Ⅲ期之间存在着显著的统计学差异，由此可见这是本实验蛋白印迹方法所得到的又一个发现。 结论:综上所述，本研究通过蛋白印迹实验方法提示乳腺癌中MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2蛋白的表达与良性乳腺肿瘤组织的表达存在显著差异。那么MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2蛋白的的联合检测可以提示乳腺癌的发病情况。在TNM分期Ⅱ，Ⅲ期之间MMP-2以及TIMP-2存在着显著的统计学差异，即MMP-2和TIMP-2对于Ⅱ，Ⅲ期乳腺癌患者的肿瘤恶性行为以及在预后和治疗方面都有提示和指导作用，反应肿瘤有更高的恶性生物学行为以及可能成为乳腺癌不良预后的一个指标。本研究还通过免疫组化实验观察到MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2蛋白在乳腺癌组织中的表达情况，多定位于癌细胞的细胞质中，少表达于间质细胞，细胞核中无表达。

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实验结果

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结 论

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综述 膜型基质金属蛋白酶与肿瘤的侵袭和转移

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