寻常型天疱疮抗原Dsg3基因的真核表达及在临床检测中的应用

摘要

寻常型天疱疮(Pemphigus vulgaris，PV)是一种慢性、复发性的大疱性皮肤病，以皮肤和粘膜出现水疱、大疱为特征。PV患者体内的自体反应性IgG与角质形成细胞表面结合，破坏了细胞间连接结构，导致细胞间连接的缺失，形成表皮内水疱。PV患者自身抗体的靶分子被证实是桥粒结构的一种成分-跨膜桥粒核心糖蛋白3(desmoglein，Dsg3)，属于钙粘蛋白超家族的成员。从Dsg的氨基酸序列推论显示，它和钙依赖细胞黏附分子有同源性，而桥粒的跨膜糖蛋白Dsgl，也是落叶型天疱疮的自身抗原。 和典型的钙粘素一样，PV抗原有5个大约相似的细胞外的结构域，称为ECl(氨基端)-EC5(羧基端)。通过X射线衍射晶体分析法显示钙粘蛋白的氨基末端的三维结构有一个重要的二聚体结构，称为二聚体链。虽然有很多粘连抑制性抗体被发现与EC1结合，但是很多粘连抑制性抗体和刺激性抗体也和其他的胞外段结合，包括EC5和EC3。另外，在一些人的组织中也发现有上皮细胞钙粘蛋白的EC2和EC3的自然突变的发生，在细胞外功能区的上皮细胞钙粘蛋白的钙离子结合部位的突变可以造成粘着功能的丧失。另外，用生理物理学直接测量钙粘蛋白外功能区分子力的研究还发现复杂的粘着物相互作用的证据，当外功能区完全重合时，粘着力最大。虽然没有研究证实特异性结合位点，仍然认为5个细胞外功能区在上皮细胞钙粘蛋白相互作用中起重要的作用。 有人已经用杆状病毒表达系统获得人Dsg3重组蛋白质，包括Dsg3的整个细胞外功能区域，并已经过人PV患者血清的天然抗体证实。但是，哺乳动物表达系统在蛋白质加工方面比杆状病毒表达系统更高级，哺乳动物表达系统中的重组蛋白与其天然结构更加一致。 这个研究中，应用哺乳动物表达系统，我们获得Dsg3整个编码区的重组体蛋白。我们关注PV患者血清和重组蛋白Dsg3的免疫反应性，并且被一组PV患者的血清证实。另外，我们想用重组的Dsg3细胞外功能区作为抗原，并用特殊的ELISA方法检测与这些抗原发生反应的抗体，可用于PV的临床检测。 材料和方法： 一、病例和主要试剂 1、PV患者组：PV患者40人均来自辽宁省内，其中男22名，女18名，年龄14～60岁，平均38岁±14岁，为中国医科大学附属第一医院皮肤科住院患者。所有病例均经临床、组织病理及免疫病理证实。正常对照组：本院健康献血者40名。 2、质粒、菌株及细胞：真核质粒pcDNA3.1<'TM>/myc-His(-)B由北京军事医学科学院张兆山教授惠赠。菌株TG1、人宫颈癌细胞系Hela细胞由中国医科大学病原微生物教研室提供。 3、主要试剂：Ni-NTA purification system、脂质体转染试剂盒脂质Lipofectamine<'TM> 2000和G418(Geneticin)为美国Invitrogen公司产品，QIAprepSpin Miniprep Kit(提质粒试剂盒)为Qiagen公司产品，购自基因公司，胰蛋白酶(Trypsin)、 RPMI1640培养基为美国Hyclone公司产品，限制性内切酶、碱性磷酸酶及T4 DNA连接酶、RNA easy Mini kit、Plasmid purification Miniprep kit试剂盒等分别购自Takara生物工程公司及Promega公司。 4、主要仪器：二氧化碳培养箱；超净工作台；低温超速离心机；紫外分光光度计；自动凝胶电泳成像系统；通用电泳仪；-80℃深低温冰箱；显微镜。 二、实验方法 1、RNA模板的提取及cDNA的获得。 2、Dsg3 EC1-EC5 cDNA片段的扩增、重组克隆的构建及鉴定。 3、脂质体Lipofectamine<'TM> 2000介导的稳定转染Hela细胞。 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶蛋白电泳(SDS-PAGE)鉴定表达产物。 5、重组蛋白质的纯化及Western-blot鉴定。 6、重组Dsg3 EC1-EC5蛋白在临床的应用。 结论： 真核表达的Dsg3 EC1-EC5蛋白与寻常型天疱疮患者血清中的抗体发生反应特异性反应，更接近自然状态下寻常型天疱疮抗原，可作为PV诊断及病情评估的依据。

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实验结果

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结论

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综述 桥粒芯糖蛋白与寻常型天疱疮关系及研究进展

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