TNFα引起肝肾综合征肾小球滤过率下降的机制研究

摘要

本研究采用肿瘤坏死因子α(TNFα)处理原代培养的GMCs，检测其对胞浆Ca<'2+>浓度、细胞收缩程度、IP<,3>RI蛋白、IP<,3>RI mRNA表达水平及IP<,3>RI启动子活性的影响，探讨TNFα在其中的作用；同时探究TNFα对PKCα活性的影响，以及PKCα在TNFα-IP<,3>RI mRNA表达增加中的信号转导作用，为HRS时GFR下降的发生机制提供理论依据。 研究材料与方法： 1、材料： 选择雄性Wistar大鼠，原代分离大鼠肾小球系膜细胞，并置于10％FCSDMEM培养液，37℃CO<,2>培养箱中培养，原代培养2周后常规传代，经倒置显微镜形态学鉴定及免疫荧光抗α-肌动蛋白抗体染色阳性、抗角蛋白抗体染色阴性鉴定为系膜细胞，取3-8代细胞用于实验。 2、方法： (1)分组：分组1：TNFα处理0h、2h、4h、8h、24h组；分组2：对照组(D组)、TNFα处理8h组(T组)、L-苏式二氢神鞘氨醇(safingol)处理8h组(S组)、TNFα与safingol共处理8h组(TS组)。每组设2个样本，并用不同代细胞重复4次。 (2)应用Fluo-3/AM荧光标记技术及共聚焦显微镜检测单个细胞内Ca<'2+>浓度动态变化，观察TNFα对胞内Ca<'2+>浓度的影响。 (3)通过对收缩前、后的GMCs表面积进行测量得出细胞收缩的幅度，借以探讨TNFα对GMCs收缩敏感性的影响。 (4)应用免疫细胞化学、Westem blot、Real-time PCR方法检测TNFα对GMCs中Ⅰ型IP<,3>R蛋白及其mRNA表达的影响。 (5)将重组质粒PGL<,3>-IP<,3>R<,1>promoter转染GMCs，通过检测萤火虫荧光素酶(luc)报告基因的表达活性，说明TNFα对IP<,3>RI启动子活性的影响。 (6)应用免疫荧光、体外磷酸化、Western blot方法研究TNFα对PKCα活性及PKCα蛋白表达的影响。 (7)用Real-time PCR方法检测抑制PKCα活性对TNFα上调IP<,3>RI mRNA表达的影响。 研究结果： 1、[Ca<'2+>]i测量结果Fluo-3/AM标记后显示，内皮素(ET)刺激可使GMCs胞内钙离子浓度在短时间内有个迅速、显著的增加。TNFα孵育4h、24h组上述效应明显增强，两组[Ca<'2+>]i上升幅度与对照组相比均有显著性差异(p<0.05)，但TNFα处理4h与24h无显著差异(p>0.05)。上述效应可被2-氨基乙基二苯硼酸盐(2-APB)完全阻断。 2、GMCs表面积测量结果对照组加入ET约lmin时，即出现可见的细胞收缩变化；4min时细胞形态变化最为明显，细胞面积明显缩小。TNFα孵育4h、24h组上述效应明显增强，细胞面积缩小的更加明显，以24h组为著，两组与对照组相比差异显著(p<0.01)。 3、免疫细胞化学检测Ⅱ型IP<,3>R结果Ⅰ型IP<,3>R主要分布于GMCs的胞浆内，以靠细胞核附近的胞浆分布较为集中，在对照组表达水平较低。TNFα孵育4h-24h组均可发现棕褐色阳性信号增强，阳性细胞百分比增加，以24h时最为明显，各组与对照组比较差异显著(p<0.05)。 4、Western blot定量分析Ⅰ型IP<,3>R表达对照组Ⅰ型IP<,3>R表达水平较低；TNFα处理4h-24h组与对照组相比Ⅰ型IP<,3>R蛋白的表达明显增高，以24h最为明显，与对照组比较有显著差异(P<0.05)。 5、实时定量PCR检测I型IP3RmRNA表达TNFα处理2h-24h组与对照组相比，Ⅰ型IP<,3>RmRNA的表达增高，以TNFα处理8h时最为明显，差异显著(P<0.05)。 6、IP<,3>RI启动子活性检测在对照组GMCs内，Ⅰ型IP<,3>R启动子活性很弱；TNFα处理4h-24h组，Ⅰ型IP<,3>R启动子活性增强，以TNFa处理8h最为明显，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。 7、免疫荧光检测PKCα的分布对照组PKCα定位于胞浆内，呈散在分布； TNFα处理8h-24h组，PKCα转位于核周分布且部分转位于核内分布。 8、免疫沉淀后PKCα活性检测对照组即存在相当活性的PKCa：TNFα处理8h-24h组PKCα活性明显增强，以TNFα处理8h最为显著(P<0.05)。 9、Westem blot定量分析PKCα蛋白表达GMCs中PKCα蛋白呈高水平表达，但PKCα蛋白的表达在TNFα处理各组与对照组间无显著差异(p>0.05)。 10、Real-time PCR方法分析PKCα抑制剂对TNFα上调Ⅰ型IP<,3>RmRNA表达的影响T组Ⅰ型IP<,3>RmRNA呈高水平表达；TS组与T组相比，Ⅰ型IP<,3>R mRNA的表达明显下降，差异显著(P<0.05)。 研究结论： 1、TNFα可增加ET刺激引起的胞内钙离子浓度。 2、TNFα增加ET刺激引起的胞内钙离子浓度是通过IP<,3>Rs来产生效应的。 3、TNFα对ET引起的GMCs收缩起着协同作用。 4、TNFα处理的GMCs中，IP<,3>RI蛋白的表达及IP<,3>RImRNA的表达明显增强，而且IP<,3>RI mRNA表达的上调在时相上先于IP<,3>RI蛋白的上调，说明TNFα可在IP<,3>RI mRNA的转录水平上进行调控。 5、TNFα处理的GMCs中，Ⅰ型IP<,3>R启动子活性明显增强，说明其可通过增强Ⅰ型IP<,3>R启动子活性来诱导转录I型IP<,3>RmRNA。 6、TNFα处理的GMCs中，PKCα存在明显激活现象。 7、应用PKCα抑制剂后，TNFa增强Ⅰ型IP<,3>R mRNA表达的作用被明显阻断，揭示了PKCα是TNFα-IP<,3>RImRNA表达通路的重要信使。

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中文论著摘要

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英文缩略语

论文一TNFα对系膜细胞收缩及胞内钙离子浓度的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二TNFα增强系膜细胞Ⅰ型IP3R表达

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文三PKCα在TNFα增强Ⅰ型IP3R表达信号转导中的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新点自我评价

参考文献

综述 肝肾综合征肾血流减少机制

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