T淋巴细胞分泌的MIP-1α与人脑微血管内皮细胞膜受体CCR5相互作用：Aβ依赖性促进T淋巴细胞穿过血脑屏障

摘要

本文选择6T-CEM细胞作为AD病人T淋巴细胞的模式细胞，着重探讨了MIP-1α-CCR5相互作用在AD病人T淋巴细胞穿过血脑屏障过程中所发挥的生物学功能，同时通过建立Aβ脑内沉积动物模型，发现注射至大鼠海马的Aβ<,1-42>能够诱导外周血T细胞MIP-1α依赖性进入脑实质，最后通过体外小胶质细胞原代培养对T淋巴细胞和小胶质细胞之间的“交流”进行了初步探讨，为进一步研究T淋巴细胞在AD病人脑内发挥的作用以及对AD的治疗提供了理论基础。 研究方法： 一、探讨MIP-1α在T淋巴细胞(6T-CEM)穿过HBMEC单层过程中的作用。 1、细胞培养。 (1)HBMEC细胞培养于含10％胎牛血清，10％Nu血清的RPMI1640培养液。 (2)61-CEM细胞培养于10％新生牛血清的RPMI1640培养液。 2、免疫荧光技术检测紧密连接蛋白ZO-1表达。 (1)6T-CEM以时间方式或rhMIP-1α以时间和浓度方式与HBMEC共同孵育后，通过免疫荧光法观察紧密连接蛋白ZO-1分布。 (2)6T-CEM、MIP-1α中和抗体与HBMEC共同孵育后检测紧密连接蛋白ZO-1分布。 3、跨内皮迁移实验分析6T-CEM穿过HBMEC单层能力及HBMEC单层通透性研究。 (1)6T-CEM与不同浓度的rhMIP-1α加入BBB体外模型Transwell上室作用20h后，计数穿过进入Transwell下室的细胞数。 (2)6T-CEM与不同浓度的MIP-1α中和抗体加入BBB体外模型Transwell上室作用20h后，计数穿过进入Transwell下室的细胞数。 (3)Transwell上室中加入相同浓度rhMIP1-α，分别孵育不同时间，或者加入不同浓度的rhMIP-1α孵育6h，测定跨上皮细胞电阻(Trans Epithelial ElectricalResistance，TEER)，然后通过加入辣根过氧化物酶(HRP)进行HRP flux分析。 二、探讨HBMEC膜受体CCR5在6T-CEM穿过HBMEC单层过程中的作用 1、应用Western blot方法分析不同处理因素下HBMEC细胞膜上CCR5受体及ROCK激酶表达 (1)6T-CEM与HBMEC分别孵育不同时间后，检测HBMEC膜受体CCR5表达。 (2)rhMIP-1α以浓度和时间方式与HBMEC作用后，检测HBMEC膜受体CCR5表达。 (3)rhMIP-1α与HBMEC分别孵育不同时间后，或rhMIP-1α作用于分别经过CCR5中和抗体2D7和ROCK特异性抑制剂Y27632处理的HBMEC后，检测HBMEC中cofilin磷酸化情况。 (4)Aβ以浓度与时间方式与HBMEC作用后，检测HBMEC膜受体CCR5表达。 2、真核表达载体构建及稳定细胞转染方法建立高表达CCR5的HBMEC细胞株 (1)重组质粒pUCmT-CCR5的构建 ①以CCR5的基因序列，依据引物设计原则设计引物，PCR扩增HBMEC中CCR5基因片断。 ②T-A克隆将CCR5基因片段连接到pUCmT载体上，命名为pUCmT-CCR5。 ③将重组质粒pUCmT-CCR5转化感受态细菌DH5α，通过蓝白筛选，酶切鉴定，验证插入片段的存在。 ④送交测序，验证插入片段序列的正确性。 (2)真核表达载体构建 ①提取pUCmT-CCR5 (含有CCR5基因)和Invitrogen公司载体pcDNA3.1/Myc-HisA质粒DNA，将CCR5基因全长(1kb)定向克隆至pcDNA3.1/Myc-HisA，命名为pcDNA3.1/MH-CCR5。 ②双酶切验证克隆是否成功，将pcDNA3.1/MH-CCR5送交测序，验证CCR5基因读码框的正确性。 ③利用Qiagen Midi rep质粒DNA中量提取试剂盒，分别提取pcDNA3.1/Myc-HisA和peDNA3.1/MH-CCR5质粒DNA。 (3)稳定转染HBMEC细胞 ①利用Fugene<'TM>6 transfection reagent，对HBMEC进行转染，通过10-14天的G418筛选，挑取单克隆，扩大培养，形成能够稳定传代的细胞克隆株。 ②利用CCR5的抗体，通过Western blot方法检测CCR5蛋白的表达，以此来鉴定转染成功的单克隆细胞株。 3、免疫荧光技术检测紧密连接蛋白ZO-1表达 6T-CEM与CCR5中和抗体2D7预处理的HBMEC共同孵育后检测紧密连接蛋白ZO-1分布。 4、跨内皮迁移实验分析6T-CEM穿过HBMEC单层能力 (1)6T-CEM细胞加入BBB体外模型已形成HBMEC(CCR5+)单层的Transwell上室作用20h后，计数穿过进入Transwell下室的细胞数。 (2)6T-CEM细胞加入到经CCR5中和抗体2D7预处理的BBB体外模型Transwell上室作用20h后，计数穿过进入Transwell下室的细胞数。 5、双重免疫荧光技术观察HBMEC膜受体CCR5和MIP-1α的定位 三、探讨大鼠脑内Aβ<,1-42>沉积对T细胞迁移入脑的影响 1、Aβ<,1-42>脑内沉积动物模型的建立及标本采集与处理。 (1)制备聚集态Aβ<,1-42>和Aβ<,42-1>，通过立体定位仪将Aβ<,1-42>注射到Wistar大鼠双侧海马，对照组注射等体积Aβ<,42-1>和PBS。 (2)标本采集与处理。 ①心脏采血，肝素抗凝。 ②经左心室依次灌注生理盐水和4％多聚甲醛，立即取脑。 ③脑组织经后固定和蔗糖溶液浸泡，冰冻切片机上行冠状切片，片厚10μm。 ④通过NycoPrep<'TM> 1.077 A and MagCellect Rat CD3+T细胞分离试剂按照产品说明书操作规程从肝素化的大鼠全血中分离T淋巴细胞。 ⑤Trizol提取大鼠T细胞总RNA并反转录成cDNA。 2、双重免疫荧光技术观察Aβ<,1-42>沉积对脑微血管内皮细胞膜受体CCR5表达及T细胞穿过血脑屏障的影响。 (1)利用vwF和CCR5的抗体，通过双重免疫荧光技术观察脑微血管内皮细胞膜受体CCR5表达。 (2)利用CD3抗体，通过免疫荧光技术观察脑内T细胞分布。 (3)大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗体，观察阻断MIP-1α的效应对T细胞穿过血脑屏障的影响。 3、半定量PCR方法检测Ap<,1-42>脑内沉积大鼠T淋巴细胞MIP-1α表达情况。 研究结果： 1、T淋巴细胞分泌的MIP-1β促使其穿过HBMEC单层能力增强(1)表达MIP-1β的T淋巴细胞(6T-CEM细胞)或rhMIP-1α与HBMEC相互作用后，引起HBMEC间的紧密连接结构紊乱。 (2)rhMIP-1α能够促使6T-CEM穿过HBMEC单层能力增强，而经过MIP-1α中和抗体处理或针对MIP-1αsiRNA干扰后的6T-CEM穿过HBMEC单层能力降低，同时紧密连接结构基本保持完整。 2、HBMEC膜受体CCR5介导了T淋巴细胞穿过HBMEC单层过程。 (1)6T-CEM或rhMIP-1α与HBMEC相互作用，均引起HBMEC膜受体CCR5表达升高。 (2)成功构建真核表达载体pcDNA3.1/Myc-HisA-CCR5及稳定表达CCR5基因的HBMEC细胞克隆株。 (3)6T-CEM穿过高表达CCR5的HBMEC单层能力增强，而加入CCR5中和抗体2D7后，6T-CEM穿过HBMEC单层能力降低，并且紧密连接结构基本保持完整。 (4)rhMIP-1α能够与HBMEC细胞膜上的CCR5配体．受体共定位。 (5)MIP-1α-CCR5相互作用通过ROCK信号途径引起紧密连接紊乱。 3、大鼠脑内Aβ<,1-42>沉积诱导T淋巴细胞MIP-1α依赖性迁移入脑。 (1)Aβ<,1-42>能够上调HBMEC细胞膜上CCR5受体表达。 (2)成功制备Aβ<,1-42>在脑内沉积的动物模型。 (3)并且在脑内沉积的模型动物中Aβ<,1-42>沉积也能够诱导外周血T淋巴细胞MIP-1α和脑内皮细胞上CCR5表达升高，最终引起外周血T细胞MIP-1α依赖性穿过血脑屏障。 研究结论： 1、T淋巴细胞分泌的MIP-1α与HBMEC细胞膜上的CCR5受体相互作用，通过激活HBMEC细胞中ROCK信号通路引起紧密连接结构紊乱，导致紧密连接开放，使T淋巴细胞穿过HBMEC单层能力增强。 2、大鼠脑内Aβ<,1-42>沉积能特异性地诱导外周血T细胞中MIP-1α和脑血管内皮细胞膜上CCR5受体的高表达，最终引起外周血T细胞MIP-1α依赖性入脑。 3、T淋巴细胞分泌的MIP-1α不能协同Aβ引起小胶质细胞的活化及Aβ吞噬，但可能与脑内其他因素共同作用参与复杂的免疫反应过程，从而最终完成Aβ清除。

目录

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中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

论文一T淋巴细胞表达MIP-1α与其穿过人脑微血管内皮细胞单层相关

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二MIP-1α与人脑微血管内皮细胞膜受体CCR5相互作用启动T淋巴细胞穿过人脑微血管内皮细胞单层

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三大鼠脑内Aβ沉积诱导T淋巴细胞MIP-1α依赖性迁移入脑

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文四探讨T淋巴细胞分泌的MIP-1α在Aβ反应性小胶质细胞活化中的作用

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述细胞紧密连接的结构组成及其调控的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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