应用RAPD对申克孢子丝菌线粒体类别进行4型内及种群分析

摘要

目的： 应用RAPD方法对36株mtDNA-4型申克孢子丝菌的基因组DNA进行多态性分析，比较此型内部菌株间的差异；通过对24株mtDNA1～24型申克孢子丝菌代表菌株的基因组DNA多态性分析，初步探讨mtDNA分型和RAPD分型之间的关系。 材料和方法： 一、实验材料 实验菌株：36株来自中国北方地区的申克孢子丝菌临床分离菌株，为mtDNA-4型。24株来自不同国家、地区申克孢子丝菌代表菌株，为mtDNA1～24型。 二、实验试剂 1、基因组DNA提取主要试剂 (1)基因组DNA提取液2％(W/V)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide十六烷基三甲基溴化铵) (2)Tris饱和酚 (3)氯仿 (4)异戊醇 (5)0.5mol/L乙酸铵 (6)99％乙醇 (7)75％乙醇 (8)TE (trisaminomethane-ethylenediaminetetraacetic acid)10 mmol/L Tris．Cl(ph8.0)1mmol/L EDTA(ph8.0) 2、PCR主要试剂 (1)真菌随机引物 OPBG01 5′-GTGGCTCTCC-3′ OPBG14 5′-GACCAGCCCA-3′ OPBG19 5′-GGTCTCGCTC-3′ OPB07 5′-GGTGACGCAG-3′ OPAA11 5′-ACCCGACCTG-3′ OPD18 5′-GAGAGCCAAC-3′ OP02 5′-(GACA)<,4>-3′ OP08 5′-TGCCGAGCTG-3′ (2)5U/ul TaKaRa Taq(DNA聚合酶) 三、主要实验仪器 (1)蒸汽高压消毒箱(美国Tuttnauer 2540MK型) (2)PH4000AB型电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司) (3)紫外凝胶成像系统(英国Gel worker eD，UVP GDS 8000) (4)全能型高性能台式冷冻离心机(德国Heaeus，Biofuge Stratos) (5)05RP-22离心机(Hitachi) (6)HZO-X100震荡培养箱(哈尔滨市东联电子开发有限公司) (7)电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-Ⅲ2型) (8)电泳槽(北京六一仪器厂，DYY-Ⅲ2型) (9)PCR扩增仪(德国Biometra，T-Gradient) 四、实验方法 1、菌种基因组DNA的提取采用CTAB法提取36株来自我国北方地区的临床分离菌株(mtDNA-4型)及24株来自不同国家地区的保存菌株(mtDNA1～24型)的基因组DNA，调整浓度至lOOng/ul以备PCR扩增。 2、PCR扩增 (1)利用8个随机引物分别进行扩增，筛选出对所有的菌株具有良好扩增片段的引物OPB07、OPBG14、OP02进行正式实验，其中应用OP02对mtDNA1～24型菌株进行扩增。 (2)PCR反应体系：总体积为25ul引物(100pmol/ul) lulTaKaRaTaq(5U/ul) 0．25ul10×buffer(含MgCl<,2>) 4uldNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mmol/L) 4ultemplate DNA(100ng/ul) 1ul (3)PCR反应条件： 94℃5min预变性； 45个循环：94℃ 1min变性、36℃ 1min复性、72℃1min延伸； 后延伸72℃7min。 (4)结果检测 PCR产物在质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶上80伏特电压下电泳并在紫外透射仪下观察并用凝胶一次成像仪照相。 3、数据处理 (1)数据转换首先用PCR Marker作为分子量标记，确定各反应条带在凝胶成像上的相对位置。在同一分子量水平上，有反应条带记作“1”，无反应条带记作“0”。将所有菌株的反应条带都转换为“1”，“0”组成的数据组。 (2)单匹配系数SM的计算公式为SM=2×nxy/(nx+ny)×100％，nxy：两菌株共有的DNA条带数，nx：x菌株的DNA条带数，ny：y菌株的DNA条带数。 (3)聚类分析统计学处理根据PCR产物带型，用NTSYS-PC2.02版软件包中的UPGMA聚类分析法进行单匹配系数SM的计算和树状图自动生成。 结论： 应用RAPD方法可对mtDNA-4型的申克孢子丝菌进一步分为4个亚型，为孢子丝菌病的分子流行病学研究提供依据；初步提示RAPD分型与mtDNA分型之间具有一定的一致性。

目录

中国医科大学研究生学位论文独创性声明及版权使用授权书

中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述孢子丝菌病诊治进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介