5-FU诱发大鼠离体气管上皮损伤修复过程中Nanog表达及超微结构观察

摘要

近年来，有学者研究提出胚胎干细胞相关基因组概念，它们仅在胚胎干细胞中表达，而在成熟体细胞中无表达，其中包括Oct3/4，Sox2，Nanog基因等。同源蛋白转录因子Nanog是最近在小鼠和人的胚胎干细胞(ESC)中发现的一类新的特异性分子标记，它是哺乳动物胚胎全能干细胞的标志物，在维持其未分化状态中起重要作用，成体细胞中则不表达。那么，使用5-FU制造大鼠气管损伤模型中的干细胞是否为机体应激状态下形成，其中是否有Nanog的存在，在其增殖分化过程中Nanog的变化趋势如何呢?国内外尚无报道。本研究利用5-FU制造大鼠气管损伤模型，观察Nanog的动态变化，以探讨气管干细胞形成及保持未分化状态的分子机制。另外本实验采用扫描电镜，透射电镜及HE染色对照的方法观察并探讨了气管上皮损伤修复过程中上皮细胞超微结构及细胞核中染色质变化规律。 材料与方法: 1、离体大鼠气管损伤模型的制备。 耿约250克左右Wistar大鼠，雌雄不限，腹腔注射10％水合氯醛0.4ml/100g，无菌条件下取出气管，无菌PBS反复冲洗，置于DMEM/F12培养液中(含10％胎牛血清)，剪成约2-3mm的气管环，于倒置显微镜下观察纤毛摆动良好，取一组织块作正常对照；于培养液中加入终浓度为120mg/ml的5-FU，37℃，5％C02孵育12小时，弃去上述培养液，换成新鲜DMEM/F12液(含10％胎牛血清)继续培养，于换液后0、3、6、12、24、48、小时分别取出一组织块，10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成2μm厚的组织切片。另取换液后各时间点的气管组织及正常气管组织，解剖显微镜下机械剥离上皮，放于1.5ml Eppendorf管中，-70℃保存，以备总蛋白提取。另外在换液后各时间点取气管组织及正常气管组织，2.5％戊二醛固定。 2、HE染色动态观察各时间点气管粘膜上皮组织学形态改变。 3、间接免疫荧光染色检测气管上皮损伤修复过程中Nanog表达的动态变化。 石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，非免疫动物血清封闭，一抗用兔抗Nanog，二抗为FITC标已山羊抗兔1gG，用Hoechst复染细胞核。50％缓冲甘油封片，荧光显微镜Olympas-BX51下观察并照相。阴性对照实验：用等量的0.01mol/LPBS代替一抗，其余步骤同前。 4、气管上皮Nanog蛋白的半定量检测。 取5-FU作用前后的气管上皮组织，提取总蛋白质。用Western blot分析Nanog蛋白的表达情况。 5、扫描电镜及透射电镜观察气管上皮细胞超微结构，特别是染色质的变化。 结论: Nanog在G0期干细胞中有表达，推测体细胞受到非常刺激后基因组再编程，具有干细胞的特点和功能，进而完成气管上皮的损伤修复。Nanog在于细胞中高表达，随着细胞分化,其表达下降，直至消失。说明Nanog对保持细胞未分化能力起重要作用。 在气管干细胞分化过程中，染色质构象出现有规律的变化。干细胞的分化伴随着异染色质的减少和常染色质的增多。

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综述 胚胎干细胞相关基因的研究进展

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