整合素αβ，细胞外信号调节激酶和蛋白激酶C在纤维粘连蛋白碎片诱导髓核细胞退变过程中的作用

摘要

间盘退变是一个复杂的过程，多种因素参与了间盘退变的过程。纤维粘连蛋白是一种存在于间盘细胞外基质内的糖蛋白，其可以被基质金属蛋白酶(MMP)分解为纤维粘连蛋白碎片(Fn—f)。研究表明，Fn—f在退变间盘的含量明显增加，且Fn—f有诱导间盘退变的作用。如果将Fn—f注入正常的间盘内，间盘出现退变样改变，而如果将Fn—f加入髓核细胞的培养液中，髓核细胞同样发生退变。而且已证明纤维粘连蛋白和Fn—f在细胞膜上主要的受体是整合素α5β1。但是目前对于Fn—f诱导髓核细胞退变的具体机制并不清楚。 整合素是一组细胞表面的黏附分子，是多种基质蛋白的膜受体，其可以参与细胞的信号传导，调控基因表达、细胞周期和细胞凋亡。研究表明整合素α1，α5，αv，β1，β3在正常人间盘组织内表达，这些整合素亚基在间盘内可以起到力学传导器和基质蛋白受体等作用。整合素有力学传感器的作用，其可以在细胞把力学信号转化为化学信号的过程中发挥作用。且整合素可以与间盘内多种基质蛋白相互作用，如α1β1亚单位是胶原蛋白在间盘细胞膜上的主要受体，而α5β1亚单位是纤维结合蛋白的膜受体。然而目前并不清楚整合素在退变间盘内的表达情况，而且同样不清楚整合素α5β1在Fn—f诱导髓核细胞退变的过程中起到何种作用。 细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)和蛋白激酶C(PKC)是两种重要的信号传导蛋白。已有研究表明ERK和PKC在间盘的退变过程中发挥作用，而且ERK和PKC在Fn—f诱导软骨细胞退变的过程起到了信号传导的作用。那么ERK和PKC在Fn—f诱导髓核细胞退变的过程是否发挥同样的作用？ 目的： 检测整合素α1，α5，αv，β1，β3在退变的人间盘内的表达情况。探讨Fn—f加入髓核细胞培养液中后，整合素α5β1的表达情况和ERK1/2的活化情况。研究整合素α5β1，ERK1/2和PKC在Fn—f诱导髓核细胞退变的过程中起到的作用。 方法： 术中收集人间盘髓核标本40例，分为三组：正常组(n=10)，突出组(n=15)，脱出组(n=15)。应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫沉淀技术比较整合素α1，α5，αv，β1，β3在以上三组内的表达情况，同时比较了整合素的配体—胶原蛋白(Ⅰ和Ⅱ型)和纤维粘连蛋白的表达情况。 体外分离和培养兔间盘髓核细胞，在培养液中加入110 kDa纤维粘连蛋白碎片。通过免疫印迹技术、免疫荧光技术及RT-PCR的方法，检测整合素α5β1亚基、Ⅱ型胶原蛋白、MMP9和MMP13的表达情况。通过免疫印迹技术检测ERK1/2的磷酸化情况。然后特异性抑制整合素α5β1的表达，观察Fn—f对髓核细胞有何影响。利用ERK1/2磷酸化的特异性抑制剂和PKC活化的特异性抑制剂来研究ERK1/2和PKC的作用。 结果： 1、整合素在人髓核组织中的表达情况 整合素α1，α5，αv，β1，β3在三组间盘都有表达。整合素α5在脱出组和突出组的表达分别是正常组的2.2倍和1.5倍。整合素β1在脱出组和突出组的含量分别是正常组的2.5倍和1.6倍。而纤维粘连蛋白在退变髓核内的表达同样有升高的趋势。但整合素α1，αv，β3在三组内的表达没有统计学差异。 2、Fn—f对于髓核细胞的影响 加入Fn—f后，髓核细胞的整合素α5和β1亚基表达明显增加，而Ⅱ型胶原蛋白表达下降，MMP9和MMP13的表达增加，同时ERK1/2的磷酸化也明显增强。 3、整合素α5β1在Fn—f诱导髓核细胞过程中的作用 特异性抑制整合素α5β1表达后，Fn—f不能诱导髓核细胞退变，Ⅱ型胶原蛋白、MMP9和MMP13的表达没有变化，ERK1/2的磷酸化也并没有被增强。 4、ERK1/2和PKC的作用 ERK1/2磷酸化的特异性抑制剂PD98059和PKC活化的特异性抑制剂GF109203X加入髓核细胞的培养基中后，Fn—f诱导髓核细胞退变的作用同样被抑制。 讨论： 已有研究表明随着间盘由突出向脱出的发展，间盘退变的程度也越来越严重。即随着间盘退变进程的发展，整合素α5和β1亚基在髓核内的表达也随之增加。实验中有意义的是纤维粘连蛋白和其受体α5和β1亚基有同样的增加趋势。并在进一步的实验中证明了Fn—f可以增加其受体α5和β1亚基的表达。当然仍有很多其它因素可以影响整合素表达。缺氧环境就是整合素表达变化的重要原因之一，Risbud等发现在缺氧的环境下培养髓核细胞，可以增强细胞MAPK的活性，增加整合素亚基的表达。同样压力也可以影响整合素的表达，当间盘细胞在体外加压培养后，某些整合素亚基的表达出现下降趋势。当然以上这些实验都是在体外细胞培养的环境下进行的，由于体内环境与体外细胞培养环境有很大区别，体内多种因素共同作用于间盘造成其退变的结局，因此退变间盘内整合素表达的变化可能是这些因素共同作用的结果。 Fn—f是间盘退变过程中纤维粘连蛋白的分解产物，其含量在退变间盘内的含量明显增加。究其原因有两方面，一方面是纤维粘连蛋白在退变间盘内的表达增多，另一方面在退变过程中MMP的表达明显增加，而正是MMP将纤维粘连蛋白分解为Fn—f。而在体内实验和体外实验都证明了Fn—f有减少糖蛋白表达，促进基质蛋白分解的作用。本实验中同样证明了这个结论，Fn—f减少了Ⅱ型胶原蛋白的表达，增加了MMP9和MMP13的表达。研究Fn—f的退变机制时，Homandberg提出Fn—f的作用由Fn—f、MMP、纤维粘连蛋白、Ⅱ型胶原蛋白组成的正反馈恶性循环，即Fn—f增加了MMP的表达，增加的MMP分解纤维粘连蛋白形成更多的Fn—f，而Ⅱ型胶原蛋白的表达减少是这个恶性循环的最终结局。而本实验观察到的Fn—f减少Ⅱ型胶原蛋白的表达，增加MMP9和MMP13的表达正与这个理论一致。那么整合素α5β1在这个恶性循环中处于什么位置呢。在本研究中同样发现Fn—f有促进整合素α5、β1亚基表达作用。由于整合素β5β1在Fn—f诱导间盘退变过程中起到了膜受体的作用，而Fn—f又有促进其受体表达增加的作用，那么Fn—f对于间盘作用的恶性循环可以做进一步的探讨。可以将整合素α5β1纳入这个正反馈恶性循环，即Fn—f与髓核细胞膜上的整合素α5β1结合后，影响了髓核细胞的代谢，MMP和受体整合素α5β1的表达都增加，MMP分解纤维粘连蛋白使Fn—f的量增加，而整合素α5β1表达的增加使Fn—f的结合位点增多，促进了Fn—f诱导髓核细胞退变的作用。因此，整合素α5β1既是Fn—f在间盘细胞上的受体，同时又是Fn—f诱导间盘退变的正反馈恶性循环中的关键环节。 ERK1/2和PKC同样参与了Fn—f诱导髓核细胞退变的过程，ERK1/2的磷酸化在Fn—f的作用下明显增强。而且ERK1/2磷酸化的特异性抑制剂PD98059和PKC活化的特异性抑制剂GF109203X抑制了Fn—f诱导髓核细胞退变的作用。因此，可以认为ERK1/2和PKC同样是Fn—f诱导间盘退变的正反馈恶性循环中的环节，即Fn—f与髓核细胞膜上的整合素α5β1结合后，激活细胞内信号蛋白PKC，增强了ERK1/2的磷酸化，引起蛋白表达变化，增加了整合素α5β1和MMP的表达，减低了Ⅱ型胶原蛋白的表达，增加的MMP又进一步分解纤维粘连蛋白为Fn—f。 结论： 在退变的人间盘髓核内整合素α5和β1亚基的表达增加。Fn—f可以诱导髓核细胞退变，同时可以增加整合素α5和β1亚基表达和ERK1/2的磷酸化。且Fn—f诱导髓核细胞退变是正反馈恶性循环，整合素α5β1、ERK1/2和PKC是恶性循环中的关键环节。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语

声明

论文一 整合素在人退变椎间盘髓核组织中的表达及意义

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 整合素α5β1,细胞外信号调节激酶和蛋白激酶C在纤维粘连蛋白碎片诱导髓核细胞退变过程中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述：人类间盘的细胞外基质蛋白

在学期间科研成绩 发表论文情况(见附件)

致谢

个人简历