基于CXCR2受体拮抗剂阻断T淋巴细胞入脑对AD病变的影响及机制研究

摘要

背景及目的: 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是年龄相关的慢性神经系统退行性疾病，严重影响老年人的生活质量。因此，研究AD的发病机制，探索防治AD的干预靶点，是神经科学的工作重点。AD动物模型是研究工作的重要工具。在对AD发病因素的研究过程中，发现β淀粉样蛋白(beta—amyloid protein，Aβ)在脑内的沉积是AD发病的早期过程和中心环节。聚集态的Aβ发挥神经毒性，启动了AD的病理进程，包括胶质细胞的广泛活化、炎性微环境产生、神经元功能紊乱及死亡等。Aβ的沉积活化脑内具有吞噬活性的小胶质细胞，引起先天性免疫应答反应(innate immune response)。Aβ能否募集外周血免疫细胞穿过血脑屏障进入脑实质向炎症部位聚集，引起过继性免疫应答(adaptive immune response)尚不清楚。血脑屏障由微血管内皮细胞、基底膜和星型胶质细胞的足突构成，将脑实质和血液分开，正常情况下免疫系统的细胞和分子不能自由进入脑。但是，随着研究不断进展，人们逐渐认识到，即使在生理状态下，中枢神经系统内也存在免疫监视过程。外周淋巴细胞可以主动进入脑实质，启动脑内的免疫应答，清除可能会引起脑病变的因子。 淋巴细胞穿过血脑屏障是一个复杂的过程。淋巴细胞和微血管内皮细胞表面表达的黏附分子及其受体的相互作用发挥了重要作用。本研究室陈誉华课题组在研究AD病人T细胞穿过血脑屏障机制的过程中，发现AD病人外周血T淋巴细胞穿过血脑屏障体外模型——人脑微血管内皮细胞单层的能力显著增高；并且证实AD病人外周血T淋巴细胞高表达CXCR2受体：CXCR2受体是细胞因子受体家族的重要一员，与其配体IL—8相互作用能够驱化淋巴细胞发生体内外迁移。T淋巴细胞高表达CXCR2受体促进其穿越血脑屏障进入脑实质，但是迁移入脑后的T淋巴细胞在AD病程发展的进程中起到怎样的作用尚未清楚。基于此，在本研究中采用大鼠脑立体定向注射的方法，建立β淀粉样蛋白在脑内沉积的动物模型，同时使用CXCR2受体拮抗剂来阻断T淋巴细胞迁移入脑，旨在研究入脑的T淋巴细胞在AD病变中的作用，同时分析T淋巴细胞进入脑内可能的机制。 方法: 一、体内实验 1、采用大鼠脑立体定位注射技术将聚集态Aβ1—42注入大鼠双侧海马，腹腔注射CXCR2受体的拮抗剂SB—332235—Z或者拮抗剂的溶剂peg—400，对照组注射等体积的Aβ42—1。 2、利用免疫组织化学染色方法观察阻断T淋巴细胞入脑前后小胶质细胞表达CD11b、MHC—Ⅱ变化。 3、利用免疫荧光的方法检测阻断T淋巴细胞入脑前后神经元表达活化caspase—3片段的变化。 4、应用免疫荧光方法检测AD模型大鼠脑微血管内皮表达MHC—Ⅰ的改变。 二、体外实验 1、使用Aβ1—42作用于人脑微血管内皮细胞(HBMECs)后应用蛋白质免疫印迹(Western—blot)方法检测不同时间点MHC—Ⅰ蛋白表达的变化。 2、使用BV2培养上清液作用于HBMECs后应用Western—blot检测不同时间点MHC—Ⅰ蛋白表达的变化。 3、使用Aβ1—42刺激的BV2培养上清液作用于HBMECs后应用Western—blot检测不同时间点MHC—Ⅰ蛋白表达的变化。 4、应用流式细胞术检测Aβ1—42作用于HBMECs不同时间，内皮细胞表达MHC—Ⅰ变化。 结果: 1、成功制备了Aβ在海马部位沉积的AD动物模型。 2、大鼠双侧海马注射聚集态Aβ1—42模型组与注射Aβ42—1对照组比较，小胶质细胞活化增多。 Aβ沉积引起CD11b阳性小胶质细胞数量显著增加并活化，与对照组比，差异性显著(P<0.01)，表现为由静止的分枝状转变为活化的阿米巴状；主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类分子阳性小胶质细胞数量也比对照组显著增加(P<0.01)。 3、进入脑实质的T淋巴细胞增强了Aβ沉积所引起的小胶质细胞的活化。 大鼠双侧海马注射聚集态Aβ1—42后，腹腔注射SB—332235—Z与腹腔注射peg—400对照组相比，CD11b阳性小胶质细胞数量显著减少，MHC—Ⅱ类分子阳性小胶质细胞数量也比对照组显著减少。 4、阻断T淋巴细胞入脑可以减轻神经细胞的凋亡。 大鼠双侧海马注射聚集态Aβ1—42后，腹腔注射SB—332235—Z与腹腔注射peg—400对照组相比，抑制了海马区神经细胞凋亡。 5、AD模型大鼠脑微血管内皮细胞表达MHC—Ⅰ分子升高，可能参与T淋巴细胞入脑抗原提呈过程。 结论: 阻断T淋巴细胞入脑减弱了Aβ沉积所引起的小胶质细胞的活化，也抑制了神经元的凋亡；脑微血管内皮细胞表达MHC—Ⅰ是否参与T淋巴细胞入脑过程有待于进一步研究。

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结论

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综述 T淋巴细胞在Alzheimer's Disease中的作用

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