紫草素抑制IL-23诱导银屑病患者外周血单个核细胞产生IL-6、IL-17的研究

摘要

前言
　　 银屑病的发病机制与近年新发现的CD4+T细胞亚群-Th17关系密切。目前研究显示IL-23/Th17细胞通路是银屑病发病机制中的重要环节之一。紫草系传统中药,具有凉血、活血、解毒、透疹之功效,治疗银屑病的疗效已被临床肯定[4]。紫草素属于萘醌类化合物,为紫草发挥药理作用的主要成分,常被作为治疗银屑病的主要药物,但其作用机制尚不清楚。为此,我们将探讨紫草素对IL-23诱导银屑病患者PBMCs产生IL-6、IL-17的影响。
　　 材料和方法
　　 一、研究对象
　　 (一)病例组
　　 银屑病患者20例,均来自2009年10月至2010年3月期间中国医科大学附属第一医院住院患者,其中男12例,女8例,年龄23～55岁,平均年龄40.9±10.9岁。
　　 (二)对照组
　　 健康志愿者11例,其中男5例,女6例,年龄27～50岁,平均年龄32.1±4.8岁。患者及志愿者入组前均签署知情同意书。
　　 (三)入组标准
　　 1、近三个月未用任何治疗银屑病及免疫抑制性药物
　　 2、无肿瘤及其他自身免疫性基础疾病
　　 3、近两周无感染病史
　　 4、疾病处于进展期
　　 (四)排除标准
　　 1、年龄>60岁或<20岁
　　 2、近三个月应用治疗银屑病或免疫抑制性药物
　　 3、有肿瘤或自身免疫性疾病
　　 4、近两周有感染病史
　　 5、疾病处于静止期或消退期
　　 二、试剂
　　 重组人白介素23(rIL-23)购自BD/Pharminen公司。IL-23ELISA检测试剂盒购自R&D公司。IL-17ELISA检测试剂盒购自CUSABIO BIOTECH Co.Ltd公司。IL-6ELISA检测试剂盒购自武汉博士德公司。CCK-8购自日本同仁化学研究所。紫草素购自日本和光公司(WAKO)。环孢素A购自德国Merk公司。RPMI1640培养液和PBS缓冲液购自Hyclone公司。Ficoll液购自GE-healthcare bio-sciences AB公司。DMSO购自solarbio公司。
　　 三、方法
　　 (一)药物处理
　　 10mg紫草素溶于1mlDMSO,双蒸水定容,细胞培养液中DMSO终浓度<0.5％。100mg的环孢素溶于1mlDMSO,双蒸水定容,细胞培养液中DMSO终浓度<0.5％。
　　 (二)ELISA法检测血清IL-23的含量
　　 取银屑病患者及健康志愿者外周静脉血,离心分离血清,操作步骤参照试剂盒的说明书进行。
　　 (三)PBMCs的分离
　　 将银屑病患者外周静脉血用Ficoll进行密度梯度离心,将获得的PBMCs充分洗涤后,用RPMI1640培养液调整PBMCs的密度为6×108/L。
　　 (四)细胞培养
　　 将上述调整密度后的PBMCs细胞培养于48孔板中,每孔850μL,每个培养条件设3个复孔,在不同的刺激条件下置于37℃、50ML/L CO2孵箱中培养。
　　 (五)细胞毒性分析
　　 不同刺激条件下的PBMCs培养72h后收集细胞,将收集的各孔细胞计数后用100μLRPMI1640重悬,放入96孔板中,每孔均加入CCK-8(10μL),置于37℃、50ML/L CO2孵箱中培养4小时后,酶联免疫检测仪测OD(450nm)。按公式:细胞存活率(％)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％计算细胞存活率。As:实验孔(含细胞的培养基、CCK-8、紫草素),Ac:对照孔(含细胞的培养基、CCK-8、无紫草素),Ab空白孔(不含细胞和毒性物质的培养基、CCK-8)。
　　 (六)ELISA法检测细胞培养上清液中IL-6、IL-17的含量
　　 不同刺激条件下的PBMCs培养72h后收集细胞培养上清液,操作步骤参照试剂盒的说明书进行。
　　 结果
　　 (一)病例组较对照组血清中IL-23的含量显著升高
　　 与对照组相比,病例组血清中IL-23的含量显著升高。
　　 (二)IL-23诱导银屑病患者PBMCs产生IL-17
　　 10ng/ml、50ng/ml及100ng/ml IL-23与PBMCs共培养后,IL-23可诱导PBMCs产生IL-17。
　　 (三)紫草素对银屑病患者PBMCs产生IL-17及细胞存活率的影响
　　 ≤2ug/ml紫草素与PBMCs共培养后,可以剂量依赖的方式增加PBMCs产生IL-17。5ug/ml、7.5ug/ml、10ug/ml紫草素与PBMCs共培养后,产生IL-17的增加随紫草素剂量的增加而减少。12.5ug/ml、20ug/ml、30ug/ml紫草素与PBMCs共培养后,可以剂量依赖的方式减少IL-17的产生。与medium相比,≤12.5ug/ml紫草素与PBMCs共培养后,细胞存活率无明显下降,20ug/ml及30ug/ml紫草素与PBMCs共培养72h后,细胞存活率显著降低。
　　 (四)紫草素对IL-23诱导银屑病患者PBMCs产生IL-17及细胞存活率的影响
　　 PBMCs与IL-23共培养后,IL-23可诱导PBMCs产生IL-17,当加入7.5、10、12.5及20 ug/ml紫草素均可抑制IL-23诱导IL-17的产生。与medium相比,7.5ug/ml、10 ug/ml、12.5ug/ml紫草素与IL-23及PBMCs共培养后,细胞存活率无明显下降,20ug/ml紫草素与IL-23及PBMCs共培养72h后,细胞存活率显著降低。
　　 (五)环孢素对IL-23诱导银屑病患者PBMCs产生IL-17及细胞存活率的影响
　　 PBMCs与IL-23共培养后,IL-23可诱导PBMCs产生IL-17,加入7.5、12.5、20、30及50ug/ml环孢素均可抑制IL-23诱导IL-17的产生。与medium相比,7.5、12.5、20、30ug/ml环孢素与IL-23及PBMCs共培养后,细胞存活率无明显下降,而50u咖l环孢素与IL-23及PBMCs共培养72h后,细胞存活率显著降低。
　　 (六)紫草素抑制IL-23诱导银屑病患者PBMCs产生IL-6、IL-17,及对细胞存活率的影响
　　 PBMCs与IL-23共培养后,IL-23可诱导PBMCs产生IL-6及IL-17,当加入12.5ug/ml紫草素可抑制IL-23诱导IL-6及IL-17的产生。12.5ug/ml紫草素、IL-23与PBMCs共培养后,细胞存活率无明显下降。
　　 (七)环孢素A(CsA)抑制IL-23诱导银屑病患者PBMCs产生IL-6、IL-17及对细胞存活率的影响
　　 PBMCs与IL-23共培养后,IL-23可诱导PBMCs产生IL-6及IL-17,加入30ug/ml环孢素可抑制IL-23诱导IL-6及IL-17的产生。与medium相比,30ug/ml环孢素、IL-23与PBMCs共培养后,细胞存活率无明显下降。
　　 结论
　　 紫草素能抑制IL-23诱导银屑病患者PBMCs产生IL-6及IL-17。

目录

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结果

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结论

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