海滨锦葵胚轴诱导愈伤组织与植株再生及农杆菌介导转基因体系的初建

摘要

本文通过对耐盐经济生态能源型植物海滨锦葵这一引进物种进行了系统的组织培养试验，现已建立起良好的组织培养再生体系，并应用农杆菌介导遗传转化法建立了遗传转化体系，初步获得了Km抗性愈伤组织，经分子检测确定目的基因到达了愈伤组织内，由于时间关系只初步建立了遗传转化体系，为今后的海滨锦葵组织培养与遗传转化研究提供一些参考依据。取得的主要结论如下： 1．海滨锦葵种子灭菌首先用15％PVP溶液浸泡5min，然后用0.1％HgCl<,2>浸泡20min，最后双蒸水冲洗5次以上，清除种子表面残留的升汞，经此处理后，发芽率为90.67％，污染率为6.58％。 2．获得海滨锦葵胚轴的方法是：要首先将种子用98％浓硫酸浸泡1h，剥去种皮，手术刀切下胚轴部分，用75％乙醇浸泡灭菌10s，用无菌水冲洗干净后接种到培养基上，此法愈伤组织诱导率为88.33％，污染率为30％。 3．以海滨锦葵胚轴为外植体诱导愈伤组织时应首先完全暗培养72h，然后转入光照16h·d<'-1>、光强45μmol·s<'-1>·m<'-2>(2500lux)的培养箱内培养；基本培养基为MS培养基，用30 g·L<'-1>蔗糖、8 g·L<'-1>的agar；海滨锦葵愈伤组织诱导培养基最佳配方为：MS+IAA1.0 mg·L<'-1>+KT 0.3 mg·L<'-1>+蔗糖30 g·L<'-1>+agar 8 g·L<'-1>愈伤组织诱导率为95.57％；不定芽诱导最适培养基为：MS+IAA0.1 mg·L<'-1>+ZT 0.5 mg·L<'-1>+蔗糖30 g·L<'-1>+agar 8g·L<'-1>，不定芽诱导率为65.83％；生根最适培养基为：MS+蔗糖30 g·L<'-1>agar 8 g·L<'-1>，生根率为96.67％。炼苗移栽后，成活率可达到85％。 4.外植体对Km较敏感，Km使用浓度30mg·L<'->时愈伤组织时就不能正常增殖，全部褐化而不能正常生长，该浓度可认为是愈伤组织生长的致死浓度。确定筛选培养基为：MS+IAA 1.0 mg·L<'->+KT 0.3 mg·L<'->+蔗糖30 g·L<'->+agar 8 g·L<'-1>+Km 30mg·L<'-1>+头孢霉素350mg·L<'->。 5．预培养时间对外植体转化有直接影响，随着预培养时间的增加，抗性愈伤组织产生量呈上升的趋势，预培养6d，选择培养21d后，抗性愈伤组织产生量达到最高水平。 6．影响海滨锦葵农杆菌转化体系转化率的关键因子为转化中As的添加量，其次是侵染时间和共培养时间，农杆菌菌液浓度对转化没有明显影响。 7．初步确定的试验条件为：农杆菌侵染时间为15min；菌液浓度OD<,600>=0.5；共培养36h；As浓度为100μmol·L<'-1>。

目录

声明

摘 要

第一章前言

1.1组织培养研究进展

1.1.1植物组织培养概述

1.1.2植物组织培养的种类

1.1.3植物组织培养的应用

1.2植物基因工程研究进展

1.2.1农杆菌介导的遗传转化机理及应用概况

1.2.2植物基因转化体系的建立及其主要影响因素

1.3海滨锦葵研究现状及本研究的选题依据与目的意义

1.3.1海滨锦葵的研究现状

1.3.2本研究的选题依据

1.3.3本研究的目的意义

第二章海滨锦葵胚轴诱导愈伤组织及植株再生

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2试验方法

2.2结果与分析

2.2.1材料的灭菌

2.2.2愈伤组织诱导

2.2.3不定芽诱导

2.2.4生根培养

2.2.5炼苗移栽

2.3讨论

2.3.1外植体的灭菌

2.3.2培养条件对愈伤组织诱导的影响

2.3.3不同激素配比对愈伤组织及不定芽诱导情况的影响

2.4小结

第三章海滨锦葵农杆菌介导转基因体系的初建

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2实验方法

3.2结果与分析

3.2.1外植体对抗生素的敏感性试验

3.2.2预培养时间对转化的影响

3.2.3转化、共培养条件正交试验结果

3.2.4侵染时间对转化的影响

3.2.5菌液浓度对转化的影响

3.2.6共培养时间对转化的影响

3.2.7 As添加量对转化的影响

3.2.8 PCR检测

3.3讨论

3.3.1外植体对抗生素的敏感性试验

3.3.2遗传转化影响的主要因素

3.4小结

第四章结论

4.1海滨锦葵胚轴诱导愈伤组织及植株再生

4.2海滨锦葵转基因体系的初步建立

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表文章