胰高糖素样肽-1对人脐静脉内皮细胞内皮型一氧化氮合酶的影响及机制的研究

摘要

以动脉粥样硬化为基础的大血管并发症是2型糖尿病的主要并发症,是患者致残、致死的主要原因。其防治是内分泌、心血管及神经等相关学科关注的重点课题。
　　 内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)主要表达于血管内皮细胞,在其催化下合成和释放一氧化氮(NO)是血管内皮细胞最重要的生理功能之一。作为内皮源性的舒血管因子,NO还具有抗炎、抗氧化、抗凝、抑制血管平滑肌细胞增殖等作用,eNOS催化合成和释放NO是血管内皮细胞抵御多种致动脉粥样硬化性损伤的自我保护功能之一。目前的研究发现,2型糖尿病患者体内的多种病理变化可通过引起eNOS活性及表达异常,使NO合成障碍,说明eNOS/NO功能障碍可能是2型糖尿病患者发生内皮功能异常进而形成动脉粥样硬化的核心机制之一。
　　 胰高糖素样肽-1(glucagons like peptide-1,GLP-1)是一种肽类激素,在维持机体糖代谢稳态中发挥重要作用。2型糖尿病患者存在GLP-1分泌缺陷及作用下降,这已经成为公认的2型糖尿病糖代谢紊乱的机制之一,进而以GLP-1为核心的降糖药物被陆续研发并成功的应用于糖尿病的治疗。近期的研究发现GLP-1可引起内皮依赖性的血管舒张;该作用可被eNOS的抑制剂阻断;输注GLP-1可使小鼠冠脉血流中NO含量增加。这些研究均提示,GLP-1很可能具有上调eNOS/NO的生理作用。研究GLP-1对内皮细胞eNOS/NO的影响,可以在一定程度上阐明GLP-1发挥上述血管内皮效应的分子机制。更重要的是,由于eNOS/NO是内皮细胞抗动脉粥样硬化的主要机制之一,该研究将提示,GLP-1作为一种生理性激素,可能通过对eNOS/NO的调控发挥内源性的抗动脉粥样硬化作用,而存在于2型糖尿病患者中的GLP-1分泌缺陷及作用下降,很有可能成为该类患者合并动脉粥样硬化的机制之一,以GLP-1为核心的治疗策略也可能在有效降糖的同时具有直接的抗动脉粥样硬化作用。
　　 已知,体内存在特异性的GLP-1受体(GLP-1 rcceptor,GLP-1R),GLP-1对糖代谢的调控主要通过存在于胰岛、胃肠道和脑组织的GLP-1R介导的信号传导通路实现。近期的研究发现在血管内皮细胞也有该受体的表达,提示GLP-1R可能参与介导GLP-1对内皮细胞的调控。值得关注的是,随着对GLP-1生理作用研究的不断深入,特别是在近期对其心血管系统作用的研究中,有一些证据表明,体内可能还存在着一种目前尚未知的不依赖于GLP-1R但与GLP-1(9-36)相关的信号通路介导GLP-1的某些生物效应。GLP-1(9-36)是二肽基肽酶Ⅳ(DipeptidylpeptidaseⅣ,DPPⅣ)降解GLP-1形成的代谢产物,因不具有GLP-1R亲和力,既往被认为无生物活性。研究发现,在不表达GLP-1R的变异小鼠,GLP-1仍可舒张其肠系膜动脉,用GLP-1(9-36)可以引起与GLP-1相似甚至更强的舒血管作用,而单纯的GLP-1R激动剂却无效;以DPPⅣ抑制剂阻断GLP-1向GLP-1(9-36)的转化,可使GLP-1的作用减弱。上述研究提示,在GLP-1对血管内皮细胞的调控中,可能存在两种信号通路,即GLP-1R依赖性和GLP-1(9-36)相关的非GLP-1R依赖性通路。对于可能存在双重信号传导通路这一假设进行证实并对相关问题开展深入的研究,不仅有助于揭示GLP-1发挥内皮调控作用的分子机制,更重要的是,它提示要全面改善糖尿病患者与GLP-1水平下降相关的病理生理变化,以GLP-1为核心的治疗策略须在重视提高GLP-1R激动作用的同时兼顾如何改善非GLP-1R依赖性信号通路的作用,特别是其心血管系统的作用。
　　 目的：
　　 综上所述,本实验观察GLP-1在正常及高糖环境下对体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)NO释放、eNOS活性及磷酸化水平及其总蛋白和mRNA水平的影响,了解GLP-1对eNOS/NO是否具有上调作用;并进一步观察GLP-1R及GLP-1(9-36)在其中所起的作用,以明确在GLP-1对eNOS的调控中是否存在双重信号通路。本课题旨在通过上述研究,为进一步探讨2型糖尿病合并动脉粥样硬化的发病机制提供新的思路,为以GLP-1为核心,研发兼具降糖及抗动脉粥样硬化作用的糖尿病治疗药物提供一点实验依据。
　　 实验方法：
　　 1、HUVECs培养,在正常葡萄糖浓度(5.5mmol/L)条件下,以含不同浓度GLP-=1的培养液孵育细胞,在不同的时间点收集细胞及培养液,检测HUVECs的NO释放、eNOS活性、eNOS1177位丝氨酸磷酸化水平(p-eNOS(ser-1177))、总蛋白和mRNA水平,以了解GLP-1对eNOS/NO的调控作用;在高糖(16.8mmol/L)条件下,以含GLP-1的培养液孵育细胞,在特定时间点收集细胞及培养液,检测上述指标,以了解高糖环境是否会影响GLP-1对eNOS/NO的调控;以含相同浓度GLP-1、exenafide(一种GLP-1R激动剂)、GLP-1(9-36)的培养液分别孵育细胞,在特定时间点收集细胞及培养液,检测上述指标,再以exendin(9-39)(GLP-1R拮抗剂)和/或sitagliptin(DPPⅣ抑制剂)与GLP-1共同孵育细胞,在特定时间点收集细胞及培养液,检测上述指标,以了解GLP-1R和GLP-1(9-36)是否均参与GLP-1对eNOS/NO的调控。
　　 2、采用硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO含量,确定HUVECs的NO释放量。
　　 3、采用NOS检测试剂盒(荧光法),应用荧光酶标仪检测HUVECs内eNOS活性。
　　 4、采用Western blot法检测HUVECs内p-eNOS(ser-1177)、总eNOS蛋白表达。
　　 5、应用real time RT-PCR技术检测eNOS mRNA的表达。
　　 结果：
　　 1、在正常葡萄糖geN(5.5 mmol/L)条件下,50-5000pM的GLP-1可使HUVECs的NO释放增加(P＜0.05),eNOS活性提高(P＜0.05),且有量效关系;500-5000pM的GLP-1可提高HUVECs内p-eNOS(Ser-1177)水平(P＜0.05),5000pM的GLP-1可提高HUVECs内总eNOS蛋白水平(P＜0.05),但对eNOS mRNA水平无影响(P＞0.05)。
　　 2、在高糖(16.8mmol/L)条件下,GLP-1仍可增加HUVECs的NO释放(P＜0.05),提高eNOS活性(P＜0.05),提高HUVECs内p-eNOS(ser-1177)水平(P＜0.05)、总eNOS蛋白水平(P＜0.05),而且还可提高HUVECs内eNOS mRNA水平(P＜0.05)。
　　 3、与GLP-1相似,5000pM的exenatide或GLP-1(9-36)均可提高HUVECs的NO释放、eNOS活性、p-eNOS(ser-1177)水平、总eNOS蛋白水平(P＜0.05)。在高糖条件下,exenatide可提高eNOS mRNA水平(P＜0.05),但GLP-1(9-36)对其水平无影响(P＞0.05)。
　　 4、GLP-1R拮抗剂或DPPⅣ抑制剂或两者同时作用,均只能部分阻断GLP-1对HUVECs的NO释放、eNOS活性、p-eNOS(ser-1177)水平、总eNOS蛋白水平的影响(P＜0.05),GLP-1R拮抗剂的存在可完全阻断高糖条件下GLP-1对eNOSmRNA水平的影响(P＜0.01),DPPⅣ抑制剂对其无影响(P＞0.05)。
　　 结论：
　　 1、GLP-1对体外培养的HUVECs具有上调其eNOS活性及表达,进而增加其NO释放的作用,提示作为参与血糖调控的生理性激素,GLP-1可能在维持血管内皮正常功能中发挥作用。2型糖尿病患者存在的GLP-1分泌缺陷可能是其并发动脉粥样硬化的机制之一。
　　 2、高糖环境不影响GLP-1对HUVECs的eNOS/NO的上调作用,提示以GLP-1为核心的降糖药物可对糖尿病患者发挥改善血管内皮功能障碍进而防治动脉粥样硬化的作用。
　　 3、GLP-1R依赖的信号通路和GLP-1(9-36)相关的非GLP-1R依赖的信号通路均参与GLP-1对eNOS/NO的上调作用。有必要对后者进行深入的研究,为以GLP-1为核心,研发兼具降糖及抗动脉粥样硬化作用的糖尿病治疗药物提供实验依据。