人巨细胞病毒UL128基因编码蛋白的生物学功能研究

摘要

目的:
　　 人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)是一种普遍存在的疱疹病毒,在人群中感染率为50％-80％。正常人感染HCMV后表现为无症状的隐性或潜伏感染。而一旦人体的免疫机能发生重大变化时(如妊娠、肿瘤、HIV感染、器官移植和新生儿等),HCMV即从潜伏感染活化为继发性的增殖感染,引起严重的临床症状甚至致死。同时HCMV感染还可引起间质性肺炎、肝炎、脑炎、视网膜、肾、神经系统、肠胃系统的疾病。随着免疫低下人群患者的增多,HCMV感染及其引发的严重疾病(致盲、致死)日益受到关注。
　　 HCMV广泛的致病性是由其病毒感染多种类型细胞的能力决定的。在免疫功能低下人群中HCMV感染的首要目标为内皮细胞和上皮细胞。研究证明HCMVUL131A-128编码蛋白是病毒在内皮细胞中的复制及白细胞的播散过程中的重要决定因子。而我们在研究中发现UL128 ORF(opening reading frame)具有两个大小不同的片段,分别为519bp和642bp,我们将其命名为HCMV UL128-519bp和HCMV UL128-642bp,为了观察两个ORF片段所编码蛋白的功能是否相同及其是否在HCMV UL131A-128编码蛋白感染内皮及上皮细胞过程中发挥着各自不同的作用,故而利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与HCMVUL128-519bp和HCMV UL128-642bp编码蛋白相互作用的蛋白,这将为研究HCMV UL128基因在内皮细胞感染嗜性中所发挥的作用及揭示HCMV先天感染致病机理、解决人巨细胞病毒先天感染的防治、减少先天畸形儿出生等医学问题奠定基础。
　　 实验材料与方法:
　　 一、实验材料;
　　 标本为中国医科大学附属盛京医院病毒室保存的临床低传代分离株H;酵母表达质粒pGBKT7及pACT2-Human fetus brain librar由武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室肖庚富教授惠赠:构建表达载体的相关试剂(Takara公司);3'RACE及5'RACE试剂盒(Takara公司);酵母双杂交实验相关试剂(Sigma,公司);常用实验设备如BECKMAN台式低温高速离心机、Perkin Elmer PCR循环仪、电穿孔仪(BioRad)、全温振荡培养箱等;常用数据库及分析软件如基因组数据库、蛋白质分析数据库、凝胶成像及扫描分析软件、引物设计软件等。
　　 二、实验方法;
　　 (一)HCMV UL128两种基因片段的构建及鉴定。
　　 1、从感染了人巨细胞病毒的人胚肺中提取HCMV总mRNA,应用RT-PCR技术将HCMV mRNA反转录成cDNA,再利用PCR技术以反转录得到的cDNA为模板,从而扩增出UL128基因的两个不同大小的片段。
　　 2、将UL128基因的两种片段分别切胶纯化后与载体pGBKT7同时进行双酶切后再次纯化并连接,筛选鉴定重组克隆(pGBKT7-UL128-519bp和pGBKT7-UL128-642bp),测序并分析。
　　 (二)酵母双杂交筛选。
　　 1、检测重组质粒对酵母的毒性和自激活活性;
　　 2、采用醋酸锂法将酵母双杂交系统中的重组诱饵载体一重组质粒pGBKT7-UL128-519bp或pGBKT7-UL128-642bp与人胎脑cDNA文库质粒共同转化至酵母菌株AH109中,涂布于SD/-Leu/-Trn/-His/-Ade/X-a-gal平板上,30℃培养至菌落长出,以X-gal筛选蓝色的阳性克隆。
　　 3、回转杂交鉴定:玻璃珠法提取酵母阳性质粒。转化到大肠杆菌中TG1中进行PCR鉴定。提取质粒分别与HCMV UL128-519bp和HCMV UL128-642bp共同转化酵母菌株AH109,转化产物涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal,不能生长作为假阳性排除。
　　 4、鉴定后的阳性克隆进行测序,经Genbank生物信息学软件进行BLAST分析。本筛选过程重复进行三次。
　　 结果：
　　 一、HCMV UL128两种基因片段的构建及鉴定。
　　 1、采用特异性引物扩增出HCMV UL128-519bp和HCMV UL128-642bp基因片段,片段长度分别为519bp和642bp,
　　 2、并成功将HCMV UL128的两个不同片段克隆到酵母系统的转录结合域pGBKT7上,命名为pGBKT7-UL128-519bp和pGBKT7-UL128-642bp。经SmalⅠ及SalⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定,测序分析显示结果与预期一致。测序结果表明融合区域的读码框正确并有正确的方向。经测序证实为HCMVUL128序列且无碱基突变。
　　 二、酵母双杂交。
　　 1、证实pGBKT7-UL128两种质粒对酵母细胞无毒性及自激活效应；
　　 2、将HCMV UL128-519bp与pACT2-library共转化酵母细胞,经过2次重复筛选从SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板筛选出15个阳性克隆,HCMV UL128-642bp与pACT2-library共转化酵母后筛选出23个阳性克隆;
　　 3、阳性克隆中提取的pACT2-library文库质粒与pGBKT7-UL128质粒共转化感受态酵母,均能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上生长;
　　 4、对验证后阳性克隆质粒测序和生物信息学分析共获得以下候选基因:与UL128-519bp编码蛋白相互作用的蛋白14种候选基因分别为:易位体蛋白(TSPO)、ATPase相关的蛋白酶体(PAAF1)、羟基丙酮酸异构酶同系物(HYI)、表皮生长因子基质蛋白2(EFEMP2)、钾结合蛋白(TBKBP1)、核糖体蛋白(RPSA)、组织蛋白酶B(CTSB)等,其中与EFEMP2(EGF-containing fibulin-like extracellular matrixprotein2)高度同源的蛋白,其同源性为100％;而与UL128-642bp编码蛋白相互作用的蛋白有10种候选蛋白,分别为:色氨酰-转移核糖核酸合成酶(WARS)、精脒合酶(SRM)、coactosin-1ike1(Dictyostelium)(COTL1)、Thy-1、促分泌作用的膜蛋白传递体(SCAMP5)、富含蛋白半胱氨酸3(CRIP3)、前mRNA调节因子(PRPF8)等,其中有13个筛选克隆与Thy-1高度同源,其同源性为99％。
　　 结论：
　　 应用酵母双杂交系统分别筛选出EFEMP2和Thy-1分别与UL128-519bp和UL128-642bp编码蛋白相互作用,UL128两种不同片段筛选得到的相互作用蛋白之间未发现有相同的蛋白,UL128-519bp和UL128-642bp所编码的蛋白在HCMV感染致病过程中可能发挥不同的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述:人巨细胞病毒UL131A,UL130,UL128基因编码蛋白的生物学功能研究

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