GC/MS法测定生物样品中有毒阴离子的研究

摘要

目的：由于氰化物和亚硝酸盐具有广泛存在性和剧毒性,它们一直是我国中毒案件中常见的毒物。氰化物和亚硝酸盐的毒性主要由其分子在机体内释放出的无机阴离子-CN-和NO2-所引起,故其毒性强弱也主要取决于释出阴离子的含量。因此快速准确地检测生物样品中游离的CN-和NO2-,在毒物分析以及临床医学研究中具有重要的实际应用价值。测定CN-和NO2-的方法有分光光度法、电化学法和色谱法。其中,气相色谱/质谱法(GC/MS)综合了气相色谱和质谱的优点,具有灵敏度高、分析速度快和鉴别能力强的特点,可完成复杂生物样品中痕量组分的定性和定量分析,在生物样品分析中占有重要地位。但由于CN-和NO2-离子系水溶性无机阴离子,其强极性、水溶性和无挥发性限制了气相色谱/质谱在测定生物样品中CN-和NO2-离子的应用。本实验的目的就是探索通过对生物样品进行一系列的前处理,对无机阴离子进行浓缩富集,使其转换成极性小、挥发性强的物质,进行气相色谱/质谱分析,实现生物样品中无机阴离子的快速、准确分析。
　　 方法:
　　 1、GC/MS法测定血浆和尿中CN-的含量。在0.5mL血浆或尿中,加入0.5mL硼砂缓冲溶液(pH=10),加入5μL,0.1μg·μL-1(共计0.5μg)三溴苯(内标);向上述溶液中加入苯甲醛,涡旋振荡30s后,静置5min;在15cm(高)×1.0cm(内径)的玻璃层析柱底端填入少许脱脂棉,然后填入1.5g硅藻土;将上述溶液转移至硅藻土柱中,静置10min;用混合溶液(5mL正己烷+20μL HFB-Cl)洗脱,同时完成第二步衍生化;将脱出液置于通风橱内,N2下浓缩至近干,吸取1μL于GC/MS分析。
　　 2、GC/MS法测定血浆和尿中NO2-的含量。在0.5mL血浆或尿中,加入1mL磷酸缓冲溶液(pH=3),分别加入衍生化试剂2,3-DAN溶液和1,8-DAN溶液20μL,密封,涡旋震荡30秒,于60℃水浴中加热10min,冷却后,加入内标SKF525A(0.1mg·mL-1)5μL;缓慢加入0.5g碳酸铵至上述溶液中,调pH至8.5,涡旋振荡.30s,直至CO2完全释放;向上述溶液中加入2mL,乙酸乙酯萃取,震荡1min,3500r/min离心5min;取上清液N2气下浓缩至近干,吸取1μL进行GC/MS分析。
　　 结果:生物样品中的CN-和NO2-经衍生化处理后,不仅改善了色谱行为,减小或消除了极性大的物质可能产生的拖尾,还提高了检测器对被测物的灵敏度,降低了目标物的检测限,衍生化产物和内标在设定的色谱质谱条件下得到很好的分离且没有干扰,实现了生物样品中CN-和NO2-的快速、准确分析。在血浆样品中CN-的LOD为0.04μg·mL-1,NO2-LOD为0.005μg·mL-1(2,3-DAN衍生化),NO2-LOD为0.01μg·mL-1(1,8-DAN衍生化);尿样品中CN-的LOD为0.01μg·mL-1,NO2-LOD为0.001μg·mL-1(2,3-DAN衍生化),NO2-LOD为0.005μg·mL-1(1,8-DAN衍生化)。该方法的线性关系、精密度、回收率均较好,衍生化产物在24h内的稳定性良好。其中,NO2-测定中,2,3-DAN衍生化法在方法学方面优于1,8-DAN衍生化法。
　　 讨论:根据文中衍生物的色谱以及质谱特征,分别讨论了CN-和NO2-衍生化反应的机理:CN-测定中涉及到两步衍生化反应,第一步衍生化为苯甲醛与CN-的亲核加成反应,第二步衍生化为上述产物与七氟丁酰氯的亲核取代反应;NO2-测定中,二氨基萘和亚硝酸根离子发生重氮化反应,然后与萘环上的另一个氨基进行分子内缩合成环,生成偶氮亚氨基杂环化合物。文中分别探索了CN-和NO2-衍生化反应过程中的影响因素:CN-测定中,讨论了样品pH值、氰离子和苯甲醛柱前反应时间、苯甲醛用量对衍生化反应的影响,最终确定pH值为10、氰离子和苯甲醛柱前反应时间为5rain、苯甲醛为5μL时衍生化产物的响应值最大;NO2-测定中,讨论了样品pH值、衍生化温度、反应时间对衍生化反应的影响,最终确定pH值为3、在60℃下反应10min时衍生化产物的响应值最大。文中分别对质谱及色谱图进行了解析,探索了衍生化产物的质谱裂解规律,并对色谱图中的主要峰进行归属分析。文中讨论了在CN-测定中硅藻土柱的作用机理,即固相支持的液/液萃取,该方法集提取、衍生化、洗脱为一体,不仅简化了实验过程,而且缩短了分析时间。文中分别将两种方法与文献方法进行比较,证实本方法耗时更短、精密度和准确度更高、操作更加简便安全。
　　 结论:本文探索了GC/MS测定生物样品中有毒阴离子CN-和NO2-的实验方法。通过优化方法的样品前处理过程,使待测阴离子形成极性低、易被GC/MS识别的化合物,缩短了分析时间,提高了检测灵敏度,得到较好的重现性、准确度和线性关系,使我们能够在毒物分析以及临床医学研究中更快更准确地测定生物样品中CN-和NO2-的含量。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词

论文一 GC/MS法测定血浆和尿中氰离子的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

论文二 GC/MS法测定血浆和尿中亚硝酸盐的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述一 测定生物样品中氰离子含量的研究进展

综述二 测定生物样品中亚硝酸盐含量的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简历