氟西汀对甲基苯丙胺诱导大鼠肺动脉重构的抑制作用及其5-羟色胺转运体和受体机制

摘要

甲基苯丙胺(冰毒)属于苯丙胺类兴奋剂(amphetamine-type stimulants，ATS)，是目前世界上滥用最广泛的毒品之一。根据联合国毒品与犯罪办公室2011年报告，全球吸食冰毒的人数已经超过了吸食海洛因和可卡因的人数，已经成为仅次于大麻的世界第二大流行的毒品。2009年，全球有1370-5640万人(年龄15-64岁)在过去的一年中吸食过苯丙胺类毒品，其中东亚和东南亚的冰毒吸食者占全世界的50％以上。
　　 近些年的流行病学研究发现冰毒滥用能明显增加患原发性肺动脉高压(idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH)的危险性。已有少量的病例报告提示肺动脉高压与冰毒滥用有关，并且把原发性肺动脉高压列入了与冰毒滥用相关的严重并发症。2008年的一项临床研究报告冰毒滥用与肺高压发病率明显增加有关。然而，目前还没有直接证据表明冰毒滥用能引起肺动脉高压和肺血管重构。
　　 肺动脉高压的临床特征为肺动脉压力持续递增并伴有血管收缩、血管重构和炎症等病理改变。引起PAH的已知危险因素包括HIV感染、结缔组织疾病、药物(如，间接5-羟色胺能激动剂阿米雷司和右芬氟拉明)和毒素类。近年来的研究发现，在实验性低氧的PAH及人类的PAH中，5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)和它的转运体(serotonin transporter，5-HTT)在PAH和肺血管重构的病理改变中起着重要作用。最近的研究发现5-HTIB受体也介导了人肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)的增殖。
　　 已有大量的实验动物研究证实冰毒能引起脑内5-HT释放。Rothman等的实验证明：冰毒和其它一些苯丙胺类似物能通过5-HTT介导血小板释放5-HT机制，增加血浆中5-HT浓度。基于这些发现，我们猜测5-HTT和5-HT受体可能参与了冰毒引起的PAH和肺动脉重构。
　　 氟西汀是一种应用广泛的抗抑郁药，其机制是抑制5-HTT。已有实验证明，氟西汀对慢性低氧诱导和野百合碱诱导的大鼠PAH有保护作用。因此，本实验的目的是研究冰毒是否能引起PAH和肺血管重构，并证明5-HTT和5-HT受体是否参与了这一过程。
　　 实验材料与方法：
　　 一、建立MA诱导的肺动脉高压大鼠模型
　　 体重185±20g的雄性Wistar大鼠50只，随机分4组：对照组(control group)、甲基苯丙胺组(MA group)、2mg/kg氟西汀预处理组(MA+F2 group)和10mg/kg氟西汀预处理组(MA+F10 group)。MA+F2组和MA+F10组大鼠每天分别给予氟西汀2mg/kg和10mg/kg灌胃，对照组和MA组大鼠每天分别给予等体积的蒸馏水灌胃。一小时后，甲基苯丙胺组和氟西汀预处理组的大鼠每天一次性腹腔甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)10mg/kg，对照组一次性腹腔注射等体积的生理盐水。各组大鼠常规饲养35天。
　　 二、大鼠肺血流动力学和右心室肥厚指数检测
　　 五周后，用3%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，剥离左颈动脉，将充满肝素的PV-I聚乙烯导管连接压力换能器，测体循环压。同法将导管插入右颈静脉，经右颈静脉插入右心室，使其插入肺动脉，测量肺动脉压(多导生理记录仪，日本光电)。
　　 将大鼠处死取出心脏，仔细分离右心室(right ventricle，RV)和左心室加室问隔(left ventricle and septum，LV+S)，滤纸吸水后，分别称量RV和LV+S的重量。以右心指数(right ventricular index，RVI)作为右心肥厚的评价指标，公式如下：RVI=RV/LV+S
　　 三、肺HE染色和组织形态学检测
　　 大鼠血流动力学指标检测后，用无菌盐水驱血、3.5%福尔马林固定。取大鼠肺下叶固定、石蜡包埋后切成5μm厚的切片，HE染色。在光学显微镜下对肺血管中膜厚度和肺血管壁面积进行测量分析。分别选择各组直径50～100μm的肺小动脉，测量血管外径、内径，用肺血管中膜厚度百分比评价血管的重构，公式如下：
　　 Medial wall thickness(%)=External diameter-Internal diameter/External diameter×100%
　　 四、应用免疫组化检测肺组织中5-HTT和5-HT受体的表达
　　 石蜡包埋的肺组织切成5μm厚的切片，参照SP法和DAB试剂盒说明书操作；不同的抗体抗原修复时间、抗体浓度选择不同。
　　 五、应用Western Blot方法检测5-HTT、5-HTIB和5-HT2A受体蛋白在肺组织和肺动脉中的表达
　　 各组大鼠肺组织和肺动脉分别匀浆后，15000g、4℃离心30分钟，提取总蛋白，储存于-80℃；SDS-PAGE电泳：确定凝胶的体积和浓度，根据蛋白分子量配不同浓度的分离胶；转膜及封闭：用半干转转膜仪，根据分子量决定转膜时间；将PVDF膜放入封闭液中，4℃孵育过夜；抗体孵育；ECL显色；半定量分析。
　　 实验结果：
　　 一、MA和氟西汀对大鼠肺血流动力学的影响
　　 为确定MA和氟西汀对大鼠肺血流动力学指标的慢性作用，我们首先检测了肺动脉压体循环动脉压。结果显示，对照组大鼠平均肺动脉压力为15.9±1.6mmHg，MA组大鼠平均肺动脉压增加至17.6±3.1mmHg，但差异无统计学意义(P>0.05，vs control)。并且，各组大鼠的体循环动脉压和右心肥厚指数也没有显著变化。
　　 二、氟西汀减轻MA引起的肺损伤和肺动脉重构
　　 为了确定MA和氟西汀对大鼠肺组织和肺动脉的影响，我们做了大鼠肺组织切片HE染色，结果显示MA组大鼠肺组织出现肺泡壁明显增厚、纤维增生和毛细血管扩张；此现象在氟西汀组明显减轻，结果表明氟西汀对MA诱导的肺损伤有保护作用。
　　 肺动脉中膜厚度百分比是衡量肺血管重构的重要指标。实验发现，与对照组相比，MA组大鼠肺动脉管壁明显增厚，血管平滑肌细胞增生肥大，肺组织结构不清。与MA组比较，MA+F10组肺血管管壁变薄、平滑肌细胞排列较规则，肺组织结构清楚；而MA+F2组形态学上没有明显改观。以上结果表明MA可诱发明显的肺血管构型重建和肺损伤，氟西汀10mg/kg明显抑制了MA引起的肺血管构型重建和肺损伤。
　　 三、免疫组化分析5-HTT、5-HT1B受体和5-HT2A受体免疫反应性
　　 为了明确5-HTT、5-HT1B受体和5-HT2A受体是否参与MA引起的肺损伤或PAH，我们用免疫组织化学的方法检测了5-HTT、5-HT1B受体和5-HT2A受体在肺组织中的表达情况。结果显示，5-HTT和5-HT1B受体蛋白主要在肺动脉中层，在肺血管内皮细胞，肺血管平滑肌细胞、肺泡上皮细胞及气道上皮细胞中都有明显的阳性表达，且MA组肺动脉染色强度比Control组明显增强；MA-F2组与MA组无明显差别；MA-F10组与MA组比较5-HTT和5-HT1B受体蛋白表达显著减少。而5-HT2A受体在各组肺组织和肺动脉中的表达无明显差异。
　　 四、氟西汀对MA诱导肺组织中5-HTT、5-HT1B受体和5-HT2A受体表达的影响
　　 用Western blot方法检测肺组织中5-HTT、5-HT1B受体和5-HT2A受体表达。与对照组相比较，MA组中5-HTT蛋白表达明显增高(P<0.01)。氟西汀10mg/kg可以明显的抑制5-HTT的增加，使蛋白水平下降(P<0.05，vs MA group)；而氟西汀2mg/kg对5-HTT表达的影响无统计学意义(P>0.05，vs MA group)。
　　 与对照组相比较，MA组的肺组织中5-HT1B受体表达水平明显增高(P<0.01)。氟西汀2mg/kg使5-HT1B受体表达水平下降，但无统计学差异(P>0.05，vs MA group)；而氟西汀10mg/kg可以明显抑制MA诱导的5-HT1B受体表达增加(P<0.01，vs MA group)。
　　 各组的肺组织中5-HT2A受体蛋白表达水平无明显变化。
　　 五、氟西汀对MA诱导肺动脉中5-HTT和5-HT1B受体表达的影响
　　 为进一步探索MA诱导的肺血管重构的机制，我们用Western blot方法检测肺动脉中5-HTT和5-HT1B受体蛋白的表达情况。结果表明，与对照组相比较，MA组5-HTT和5-HT1B受体蛋白的表达均明显增高(P<0.01，MA vs control)。氟西汀剂量依赖性地抑制5-HTT和5-HT1B受体蛋白的表达，(P>0.05，MA+F2 vsMA；P<0.05，MA+F10 vs MA)，氟西汀10mg/kg可以明显抑制MA诱导的5-HTT和5-HT1B受体蛋白表达的增加，差异具有统计学意义。
　　 结论：
　　 1.本研究发现MA可导致大鼠肺动脉重构，并且引起肺动脉5-HTT和5-HT1B受体蛋白表达增加。
　　 2.10mg/kg氟西汀能减轻MA诱导的大鼠肺动脉重构，降低MA引起的肺动脉5-HTT和5-HT1B受体蛋白的高表达。