他汀和挥发性麻醉剂类药物对机体缺血再灌注损伤的作用及其机制探讨

摘要

目的：
　　缺血再灌注损伤（Ischemia Reperfusion Injury，IRI）是指缺血组织或器官重新获得血流灌注或氧供应后对组织和器官等产生的损伤作用。目前，采用预处理和后处理作用可减轻缺血再灌注造成的组织损伤。预处理是指短暂性缺血发作可降低随后严重的缺血所导致的损害的现象，后处理指在再灌注早期实施短暂的再缺血可以减少一些重要器官包括脑和心脏的缺血性损伤。应用相对安全的药物进行预处理和后处理可以简化这种保护形式并可能拥有广泛的应用前景，即药物的预处理及后处理。他汀是戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，临床上常用来降低血胆固醇水平，除了减低胆固醇外，他汀类药物还有多种其他作用，例如，它可以用作减轻骨质疏松，减慢肿瘤生长，同时可以提高心衰患者的心室功能;异氟烷为临床上常用的挥发性麻醉剂药物，应用异氟烷可以减少鼠的脑缺血损害，而其他挥发性麻醉药物是否可以诱导脑的预处理和后处理效果及诱导脑神经保护的作用机制仍不清楚。本研究拟采用他汀类药物辛伐他汀、阿托伐他汀和挥发性麻醉剂异氟烷、七氟烷、地氟烷对缺血再灌注损伤内皮细胞、类人神经细胞和脑组织进行预处理和后处理作用，观察他汀类和挥发性麻醉剂类药物对缺血再灌注损伤的影响，并探讨其可能的保护机制。
　　方法：
　　1、他汀类药物后处理对内皮细胞缺血再灌注损伤的影响
　　对牛肺动脉内皮细胞(bovine pulmonary artery endothelial cells，BPAEC)进行氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）和再灌注处理，在再灌注之初将不同剂量的他汀类药物[辛伐他汀（0.5、1、2、4、10μM）和阿托伐他汀(0.5、1、2、4、10μM)]加入牛肺动脉内皮细胞中进行后处理作用，同时分别添加相应的抑制剂 diphenyleneiodonium（DPI，20μM）、Geranylgeranyl pyrophosphate（GGPP，10、20和40μM）、mevalonate(200和500μM)、Akt的抑制剂Ly294002(10μM)、ERK的抑制剂U0126(1μM)，观察不同剂量辛伐他汀和阿托伐他汀后处理组、氧糖剥夺再灌注组、抑制剂添加组及对照组细胞中乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，LDH)的释放水平、过氧化物产物生成和ERK蛋白、ERK磷酸化蛋白p-ERK、Akt蛋白、Akt磷酸化蛋白p-Akt的表达情况。
　　2、挥发性麻醉剂后处理对缺血再灌注类人神经细胞的保护作用
　　采用维甲酸诱导SH-SY5Y细胞（人成神经细胞瘤细胞系）使其分化为最终的类人神经细胞。对诱导后的SH-SY5Y类人神经细胞进行氧糖剥夺再灌注处理，于再灌注早期应用异氟烷、七氟烷和地氟烷进行后处理作用。测量各组细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放以确定细胞损伤程度，检测GSK3β(Ser9)、GSK3β第9位丝氨酸磷酸化蛋白p-GSK3β(Ser9)的蛋白表达水平，探讨挥发性麻醉剂异氟烷对类人神经细胞的保护作用机制。
　　3、异氟烷预处理与后处理对脑缺血再灌注的作用研究
　　实验分组为对照组、大脑中动脉阻塞(middle cerebral arterial occlusion，MCAO)再灌注组、异氟烷预处理+MCAO组和异氟烷后处理+MCAO组。大脑中动脉阻塞再灌注组为阻塞成年雄性大鼠右侧大脑中动脉血液供应90 min。异氟烷预处理+MCAO组为在大脑缺血之前24 h使动物接触2％异氟烷30 min，异氟烷后处理+MCAO组是在大脑缺血后立即使动物接触2％异氟烷60 min，对脑细胞和外周血中白细胞进行免疫染色和流式细胞分析，对各组大鼠血清中SOD活性、MDA含量进行检测，对血清中炎症因子IL-1β和TNF-α含量进行检测;同时，采用real-timePCR和Western blot方法检测大鼠缺血再灌注组织中MMP-2、MMP-9、claudin-5、occludin的mRNA和蛋白表达水平。
　　结果：
　　1、他汀类药物后处理可减轻内皮细胞缺血再灌注损伤
　　他汀类药物剂量依赖地降低了氧糖剥夺和再灌注所导致的乳酸脱氢酶的释放，加入戊二酰辅酶A还原酶抑制剂GGPP、甲羟戊酸和Akt的抑制剂Ly294002可以逆转或消除他汀后处理的保护作用，但加入ERK抑制剂U0126却无此效应，说明辛伐他汀和阿托伐他汀提高了缺血再灌注牛肺动脉内皮细胞中Akt磷酸化/Akt活化的表达但不能改变ERK磷酸化/ERK活化的表达。同LDH释放数据相一致，他汀后处理抑制过氧化物的作用可被GGPP消除，氧糖剥夺和再灌注诱导的过氧化物产生及细胞损伤也可以被黄素酶抑制剂二联苯碘抑制。
　　2、挥发性麻醉剂后处理可对缺血再灌注类人神经细胞产生保护作用
　　应用异氟烷、七氟烷、地氟烷进行后处理可减少氧糖剥夺后再灌注导致的乳酸脱氢酶释放及细胞损伤。在再灌注的0h和1h应用2％异氟烷时，这种保护效果更为明显。异氟烷可在OGD后显著增加GSK3β9位丝氨酸的磷酸化，同时，抑制GSK3β可减少OGD诱导的LDH的释放。
　　3、异氟烷预处理与后处理对脑缺血再灌注所导致的细胞炎性反应的影响
　　脑缺血再灌注可增加缺血大脑半球中活化的小胶质细胞/巨噬细胞，经过异氟烷预处理或后处理后，其增加作用则不明显。脑缺血再灌注对外周血中的中性粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞百分比并无显著性影响;异氟烷预处理和后处理可降低缺血再灌注导致的炎症反应及脂质过氧化损伤，并可降低MMP-2和MMP-9对紧密连接蛋白claudin-5和occludin的蛋白水解活性，减少紧密连接蛋白的缺失，从而减轻缺血再灌注损伤。
　　结论：
　　他汀类药物辛伐他汀和阿托伐他汀后处理作用可以减少氧糖剥夺后再灌注导致的内皮细胞损伤，其作用机制可能由戊二酰辅酶A还原酶抑制剂和小GTP酶抑制所介导，Akt的活化亦可能是他汀类药物后处理产生保护性作用的机制之一;挥发性麻醉药物异氟烷、七氟烷、地氟烷后处理及异氟烷预处理同样可减少氧糖剥夺后再灌注导致的细胞损伤，其作用机制可能为通过抑制GSK3β及调节细胞炎性反应、脂质过氧化程度和金属蛋白酶及紧密连接蛋白表达发挥神经保护作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 他汀后处理对内皮细胞缺血再灌注损伤的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 挥发性麻醉剂后处理对类人神经细胞缺血再灌注保护作用的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 异氟烷预处理与后处理对脑缺血再灌注所致细胞炎性反应的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 缺血再灌注损伤机制及药物处理的作用研究

在学期间科研成绩

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