荧光标记LDR-PCR复合扩增方法对高度降解DNA检材的SNPs分型研究

摘要

前言：
　　 法医DNA分析技术的应用与发展，有力地提高了法医实践中个人识别和亲子鉴定的能力，已经成为法医学领域中最为基本和重要的技术，并且在世界范围内得到广泛认可和应用。同样，DNA分析技术也面临着诸多挑战，尤其是在实际检验过程中，法医鉴定人员有时要面对高度降解的生物学检材。
　　 为了解决高度降解DNA检材的个人识别难题，许多实验室采用缩短靶DNA片段的扩增子长度这一基本策略，其中最具代表性的就是miniSTR技术。但是受STR核心重复序列固有片段长度的限制，大多数STR基因座的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增产物长度集中介于100bp～200bp，对于小于100bp的DNA片段，miniSTR技术尚不能提供足量、可靠的遗传学信息。
　　 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是指特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，每种基因型在群体分布频率不低于1％。由于其多态性存在于单个碱基上，PCR扩增产物长度能够大幅缩短，又因其具有分布广泛，突变率低等特点，SNPs检测在降解检材的个人识别中逐渐引起法医学者的重视。
　　 近年来，一种基于连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)的SNPs分型技术得到迅速发展，为解决降解DNA法医学分析难题提供了新的契机。LDR中寡核苷酸探针在设计时需保证能与靶序列特异性地杂交，并且不能影响后续的连接反应，所以对探针长度要求并不是很严格，数十个核苷酸即能满足需要;此外，对于双链DNA的单链缺口，DNA连接酶的识别和连接反应具有高度的严谨性，适合应用于法医学降解检材的DNA分析上。目前对降解检材DNA应用LDR技术进行分析只能实现对4个SNPs位点的复合分型，尚不能满足法医学个人识别的要求。因此，本研究尝试构建一套基于LDR的荧光标记PCR复合扩增体系，能够实现对8个SNPs位点进行分型检测，提高其法医学个人识别力，同时探讨对福尔马林固定石蜡包埋组织(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues，FFPET)中降解DNA的分型的可行性，为解决高度降解DNA法医学分析难题提供新的策略。
　　 材料和方法：
　　 1、中国北方地区汉族个体末梢静脉血样，枸橼酸钠抗凝;选取一具冰冻尸体的脑、肺、心肌、肾和肝组织块按常规方法制作FFPET，同时取尸体心腔血液作为阳性对照。
　　 2、酚/氯仿法提取血液DNA，二甲苯脱蜡法和Chelex-100法提取FFPET检材DNA。
　　 3、选择8个SNPs位点(rs10802248、rs10516197、rs10488372、rs2278945、rs4757318、rs4887255、rs4889002和rs9304473)，设计合成SNPs位点的LDR探针和连接产物PCR引物，通过连接酶检测反应，PCR扩增和毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis，CGE)，构建复合扩增SNPs分型体系。
　　 4、对FFPET检材降解DNA分别进行AmpF(l)STR(R) Identifiler(R) PCRAmplification Kit分型检测和荧光标记LDR-PCR复合扩增检测，对两者分型结果进行比较。
　　 结果：
　　 1、经10％中性福尔马林溶液固定3天后所有的FFPET的DNA即发生明显的降解。随着固定时间的延长，降解程度逐渐加剧，并且不同组织类型的降解速率呈现出明显差异。15天后脑FFPET检材DNA片段降解到lkbp以下，心肌FFPET检材DNA在500bp以下，肺脏和肾脏FFPET检材DNA在200bp以下，肝脏FFPET检材DNA在100bp以下。
　　 2、本研究使用荧光标记LDR-PCR复合扩增方法，对不同个体的8个SNPs位点进行一次性分型，每个SNP位点纯合子为单一产物峰，杂合子为长度相差2bp的两个产物峰，对于扩增产物长度有所重叠着，由于使用不同的荧光标记物，能完全实现正确分型。对所有的检测个体的8个SNPs位点进行常规PCR扩增并测序，测序结果与LDR-PCR分型结果完全一致。
　　 3、对于FFPET检材高度降解DNA检材，荧光标记LDR-PCR复合扩增体系能够实现8个SNPs位点的准确分型，AmpF(l)STR(R) Identifile(R) PCR AmplificationKit则无法提供全部15个STR分型结果。
　　 结论：
　　 1、荧光标记LDR-PCR复合扩增方法能够对8个SNPs位点进行一次性分型，结果准确，可靠，是一种简单、高效并且较为实用的SNPs分型新方法，适用于高通量多位点同步检测分型。
　　 2、在高度降解DNA检材的法医学分析方面，荧光标记LDR-PCR复合扩增方法优势明显，具有极大的研究及开发价值。

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