WNT4信号通路在PAX2基因诱导肾小管上皮细胞间充质转分化中作用机制研究

摘要

肾间质纤维化(Renal Interstitial Fibrosis，RIF)是慢性肾功能衰竭进行性发展过程中的始动因素，是慢性肾脏疾病发展至终末肾病的共同途径。肾间质纤维化的关键步骤是肾小管上皮细胞向间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)即肾小管上皮细胞丧失上皮细胞表型的同时获取成纤维细胞特征。越来越多的证据表明EMT在肾间质纤维化的发生、发展中起重要作用。
　　 配对盒基因2(Paired Box2，PAX2)编码核转录因子，是肾脏胚胎发育过程中诱导肾小管上皮细胞转分化的关键性发育基因之一，在前、中、后肾发育的全过程中表达，参与胚胎肾脏各个发育阶段的调控，成熟肾单位其表达消失。近年来发现，PAX2基因在肾小球疾病肾小管上皮细胞有不同程度表达，认为PAX2回归表达可能导致EMT，进而出现肾间质纤维化。由于体内作用因素复杂，存在诸多信号通路、信号分子及细胞因子，PAX2是否能直接诱导EMT至今尚无研究。
　　 以往对EMT机制的研究主要有TGFβ1、integrin/ILK、WNT/β-catenin等通路。近年来WNT/β-catenin通路在胚胎器官发育过程中研究较为深入，该项研究显示:PAX2通过激活WNT4通路可促进S-形小管的形成及诱导后肾间充质细胞聚集并分化为上皮细胞，敲减PAX2将导致S-形小管的形成不良，间充质细胞聚集障碍而停止分化，故认为WNT4是PAX2的靶基因。在正常成熟大鼠肾脏中WNT4处于失活状态，在肾间质纤维化模型大鼠肾脏中WNT4明显升高且活性增强，证实WNT4通过调控EMT，促进肾纤维化作用，将WNT阻断后，肾脏纤维化程度减轻。但PAX2在肾间质纤维化模型大鼠肾脏重新表达后是否亦通过激活WNT4通路调控EMT至今尚无研究。
　　 本课题探讨了WNT4信号通路在PAX2诱导肾小管上皮细胞EMT中的作用及其机制。通过构建高表达PAX2质粒稳定转染至肾小管上皮细胞，观察PAX2是否可以直接诱导正常肾小管上皮细胞出现EMT;应用WNT通路阻断剂阻断WNT通路，探讨PAX2是否通过WNT通路调控肾小管上皮细胞EMT;应用WNT4siRNA沉默WNT4基因探讨WNT4基因是否为PAX2诱导正常肾小管上皮细胞EMT的调控基因。
　　 材料和方法：
　　 一、WNT4信号通路在PAX2诱导正常肾小管上皮细胞间充质转分化中的作用
　　 制备单侧输尿管结扎(unilateralurcteral obstructinn，UUO)大鼠模型，提取造模后第21天肾组织mRNA，扩增大鼠PAX2全长编码序列，将该目的基因与真核表达载体pEGFP-C1质粒（含Neo抗性基因）进行定向连接，其产物转化细菌感受态细胞，以PCR方法鉴定阳性克隆，并进行测序和分析比对，获得融合蛋白表达质粒载体pEGFP-PAX2。通过阳离子脂质体介导将重组质粒pEGFP-PAX2转染入体外培养的大鼠肾小管上皮细胞，经G418筛选，建立稳定表达PAX2肾小管上皮细胞系。
　　 实验细胞分为三组:对照组，空载组及稳转组。
　　 应用荧光显微镜、Western blot和Realtime PCR法进行转染鉴定。应用相差显微镜观察细胞形态。采用免疫荧光，Western blot和Realtime PCR检测三组细胞表型标志物E钙黏蛋白（E-cadherin）和α肌动蛋白(α-SMA)蛋白和mRNA的表达。应用细胞划痕实验观察细胞迁移率。应用Transwell实验观察细胞侵袭程度。采用免疫荧光，免疫组化，Western blot及Realtime PCR检测WNT4及β-catenin蛋白和mRNA的表达。
　　 二、WIF-1阻断WNT通路对PAX2诱导的肾小管上皮细胞间充质转分化作用的影响
　　 实验细胞分为四组:WIF-1（5ug/ml）;WIF-1(10ug/ml);WIF-1(15ug/ml);PAX2稳转对照组。
　　 应用Western blot，RT-PCR，Realtime PCR和免疫荧光方法检测β-catenin蛋白和mRNA的表达。
　　 应用Western blot，RT-PCR，Realtime PCR，免疫荧光方法检测细胞表型标志物E-cadherin和α-SMA蛋白和mRNA的表达。应用细胞划痕实验观察细胞迁移率。应用Transwell实验观察细胞侵袭程度。应用相差显微镜观察细胞形态。
　　 三、WNT4基因沉默对PAX2诱导的肾小管上皮间充质转分化作用的影响
　　 根据Geenbank设计大鼠WNT4靶向性siRNA:siRNA1 siRNA2 siRNA3，用脂质体2000分别将WNT4 siRNA转染至稳定转染PAX2肾小管上皮细胞系，应用Western blot和RT-PCR方法筛选最佳沉默位点。
　　 应用Western blot方法进行WNT4沉默鉴定。
　　 将最佳沉默位点WNT4 siRNA转染至稳定转染PAX2肾小管上皮细胞系。实验分为五组:稳转对照组，WNT4 siRNA24h组，WNT4 siRNA48h组，WNT4siRNA72h组，WNT4 siRNA96h组。
　　 应用Western blot，RT-PCR，Realtime PCR和免疫荧光方法检测β—catenin蛋白和mRNA的表达。
　　 应用Western blot，RT-PCR，Realtime PCR，免疫荧光方法检测细胞表型标志物E-cadherin和α-SMA蛋白和mRNA的表达。应用细胞划痕实验观察细胞迁移率。应用Transwell实验观察细胞侵袭程度。应用相差显微镜观察细胞形态。
　　 结果：
　　 一、WNT4信号通路在PAX2诱导正常肾小管上皮细胞间充质转分化中的作用
　　 重组质粒pEGFP-PAX2鉴定:所得的PCR片段与预期大小1200 bp左右一致。将阳性克隆测序，测序结果经blast分析，证实所插入的目的片段与genebank检索的大鼠PAX2的cDNA序列100％匹配，说明PCR过程无突变发生。以上结果证明重组质粒pEGFP-PAX2构建成功。
　　 转染鉴定稳定转染组和空载组绿色荧光强度较对照组明显增强。Western blot结果显示:转染组的PAX2蛋白表达明显高于空载组及对照组(P＜0.05); RealtimePCR结果显示:转染组的PAX2基因表达明显高于对照组(P＜0.05)，以上结果证明PAX2转染成功。
　　 转分化作用观察相差显微镜下观察:稳定转染组肾小管上皮细胞的形态较对照组及空载组伸长;细胞表型标志物表达检测:免疫荧光结果显示，稳转组细胞E-cadherin染色较空载组及对照组明显减弱;α-SMA染色较空载组及对照组明显增强;Western blot检测蛋白结果显示:稳转组的E-cadherin明显低于空载组及对照组(P＜0.05)，α-SMA明显高于空载组及对照组(P＜0.05);Realtime PCR结果显示:稳转组的E-cadherin基因明显低于空白对照组(P＜0.05)，α-SMA基因明显高于对照组(P＜0.05);细胞划痕修复实验结果显示:PAX2稳定转染后10h及18h细胞迁移率较对照组及空载组明显增加(P＜0.05);Transwell实验结果显示:PAX2稳定转染后细胞侵袭程度较对照组及空载组明显增强(P＜0.05)。以上结果证明PAX2使正常肾小管上皮细胞出现EMT。
　　 PAX2转染后对WNT4通路作用免疫组化结果显示:稳转组细胞WNT4染色较空载组及空白对照组明显增强;免疫荧光结果显示:稳转组细胞β-catenin染色较空载组及空白对照组明显增强;Western blot检测蛋白结果显示:稳转组的WNT4及β-catenin明显高于空载组及空白对照组(P＜0.05);Realtime PCR结果显示:稳转组的WNT4及β-catenin基因明显高于空载组及空白对照组(P＜0.05)。以上结果证明PAX2可能激活了WNT4通路。
　　 二、WIF-1阻断WNT通路对PAX2诱导的肾小管上皮细胞间充质转分化作用的影响
　　 WIF-1对PAX2激活的WNT通路的阻断作用Western blot检测蛋白结果显示:WIF-1（5ug/ml）、WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）组β-catenin蛋白较PAX2稳转细胞组减少，WIF-1（15ug/ml）组最明显(P＜0.05);RT-PCR和Realtime PCR结果显示:WIF-1（5ug/ml）、WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）组β-catenin mRNA较PAX2稳转细胞组减少，WIF-1（15ug/ml）组最明显(P＜0.05);免疫荧光结果显示:WIF-1（10ug/ml）和WIF-1(15ug/ml)组β-catenin染色均较PAX2稳转细胞组减弱，其中WIF-1（15ug/ml）组最明显。以上结果证明WIF-1阻断了WNT通路。
　　 转分化逆转作用观察Western blot检测蛋白结果显示:WIF-1(5ug/ml)、WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）组E-cadherin蛋白表达均较PAX2稳转细胞组增多，其中WIF-1（15ug/ml）组最明显(P＜0.05)。WIF-1（5ug/ml）、WIF-1(10ug/ml)及WIF-1（15ug/ml）组α-SMA蛋白表达均较PAX2稳转细胞组减少，其中WIF-1（15ug/ml）组最明显(P＜0.05);RT-PCR及Realtime PCR
　　 结果显示:WIF-1(5ug/ml)、WIF-1(10ug/ml)及WIF-1(15ug/ml)组E-cadherinmRNA表达均较PAX2稳转细胞组增多，其中WIF-1(15ug/ml)组最明显(P＜0.05)。WIF-1(5ug/ml)、WIF-1(10ug/ml)及WIF-1(15ug/ml)组α-SMA mRNA表达均较PAX2稳转细胞组减少，其中WIF-1(15ug/ml)组最明显(P＜0.05);免疫荧光结果显示:WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）组E-cadherin染色均较PAX2稳转细胞组增强，其中WIF-1（15ug/ml）组最明显;WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）组α-SMA染色均较PAX2稳转细胞组减弱，其中WIF-1(15ug/ml)组最明显;细胞划痕实验结果显示:WIF-1（15ug/ml）组10h及18h细胞迁移率较PAX2稳转细胞组明显减弱(P＜0.05);Transwell实验结果显示:WIF-1(15ug/ml)组细胞侵袭程度较PAX2稳转细胞组减弱(P＜0.05);相差显微镜下观察:WIF-1(15ug/ml)组细胞较稳定转染组细胞变圆，接近正常肾小管上皮细胞形态。以上结果证明阻断WNT通路后使PAX2诱导的EMT的肾小管上皮细胞出现转分化逆转。
　　 三、WNT4基因沉默对PAX2诱导的肾小管上皮细胞间充质转分化作用的影响
　　 WNT4基因沉默鉴定将WNT4 siRNA1，WNT4 siRNA2和WNT4 siRNA3分别转染至稳定转染PAX2细胞。Western blot检测蛋白结果显示:WNT4 siRNA1，WNT4siRNA2和WNT4 siRNA3三组WNT4蛋白表达较对照组均降低，以WNT4 siRNA3最明显(P＜0.05);RT-PCR结果显示:WNT4 siRNA1，WNT4 siRNA2和WNT4siRNA3三组WNT4 mRNA较对照组表达均降低，以WNT4 siRNA3最明显(P＜0.05)。以上结果证明WNT4 siRNA3沉默效率较高，故下面实验均选择WNT4siRNA3行相关检测。
　　 WNT4 siRNA3转染鉴定将WNT4 siRNA3转染至稳定转染PAX2细胞，分别于24h、48h、72h及96h收集细胞。Western blot检测蛋白结果显示:沉默24h、48h、72h及96h后，WNT4蛋白表达较未沉默稳转对照组均降低，以72h最明显（P＜0.05）。
　　 WNT4基因沉默对PAX2激活的WNT4通路的阻断作用Western blot检测蛋白结果显示:沉默24h、48h、72h及96h后，β-catenin蛋白较未沉默稳转对照组减少，72h组最明显(P＜0.05);RT-PCR和Realtime PCR结果显示:WNT4沉默24h、48h、72h及96h后，β-catenin mRNA较未沉默稳转对照组减少，72h组最明显(P＜0.05);免疫荧光结果显示:沉默72 h组β-catenin染色较未沉默稳转对照组减弱。以上结果证明沉默WNT4基因阻断了WNT4通路。
　　 转分化逆转作用观察Western blot检测蛋白结果显示:沉默24h，48h，72h及96h后，各时间点细胞中的E-cadherin蛋白表达均较稳转对照组增多，72h组增多最明显(P＜0.05)。各时间点细胞中的α-SMA蛋白表达均较稳转对照组减少，72h组减少最明显(P＜0.05);RT-PCR和Realtime PCR结果显示:各时间点细胞中的E-cadherin mRNA表达均较稳转PAX2细胞组上调，72h组上调最明显(P＜0.05)。各时间点细胞中的α-SMA mRNA表达均较稳转PAX2细胞组下调，72h组下调最明显(P＜0.05);免疫荧光结果显示:沉默72 h组E-cadherin染色均较稳转对照组增强，α-SMA染色均较稳转对照组减弱;细胞划痕实验结果显示:沉默72h组10h及18h细胞迁移率较PAX2稳转细胞组明显减弱(P＜0.05);Transwell
　　 实验结果显示:沉默72h组细胞侵袭程度较PAX2稳转细胞组减弱(P＜0.05);相差显微镜下观察沉默72h组细胞较稳定转染组细胞变圆，接近正常肾小管上皮细胞形态。以上结果证明沉默WNT4后使PAX2诱导的EMT的肾小管上皮细胞出现转分化逆转。
　　 结论：
　　 1、PAX2可以在体外诱导正常肾小管上皮细胞出现间充质转分化并且激活了WNT4通路。
　　 2、PAX2可能通过WNT通路调控上皮细胞间充质转分化。
　　 3、WNT4基因可能是PAX2诱导上皮细胞间充质转分化的调控基因。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 WNT4信号通路在PAX2诱导正常肾小管上皮细胞间充质转分化中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 WIF-1阻断WNT通路对PAX2诱导的肾小管上皮细胞问充质转分化作用的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文三 WNT4基因沉默对PAX2诱导的肾小管上皮细胞间充质转分化作用的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

在学期间科研成绩

致谢

个人简介