急性髓细胞白血病中PRDX2基因启动子甲基化及组蛋白乙酰化与其表达失活的关系

摘要

目的：
　　 为研究抑癌基因PRDX2在急性髓细胞白血病患者骨髓细胞中的表达情况，证实基因启动子区高甲基化及染色质组蛋白乙酰化水平降低与基因表达下调相关，探讨基因甲基化与组蛋白去乙酰化在导致基因沉默事件中的关系。
　　 方法：
　　 一、实验对象
　　 收集2010年6月至2012年6月中国医科大学附属盛京医院血液科住院及门诊患者95例，分为AML（急性髓细胞白血病）组和对照组。
　　 二、实验方法
　　 （一）单个核细胞（MNC）提取
　　 AML组与对照组均取肝素抗凝新鲜骨髓5ml，经等量PBS稀释混匀后，缓慢加入5ml淋巴细胞分离液中，置于自动平衡离心机中，以3000r/min离心20min，吸取界面层MNC，PBS洗涤2次，所得MNC用于提取总RNA和总蛋白。
　　 （二）引物设计
　　 MSP、Real-time PCR引物序列和反应条件见表1-2。
　　 （三）甲基化特异性PCR法检测DNA甲基化水平
　　 利用TRIzo1法同时提取RNA、DNA、蛋白，分离出RNA、蛋白后，回收DNA。紫外分光光度仪定性、定量。利用EZ DNA甲基化试剂盒(ZYMO)处理DNA样品。采用甲基化特异性PCR方法，甲基化酶处理的和未处理的正常人的外周血细胞分别为阳性和阴性对照。PCR，琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色。
　　 （四）Real-time PCR检测肿瘤抑制基因mRNA表达
　　 收集细胞，TRIzo1试剂提取总RNA，以Oligo dT为引物反转录合成cDNA（按试剂盒说明书进行），然后以各基因为引物进行PCR扩增，以GAPDH为内对照。琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色。以基因与GAPDH条带的光密度比值作为分析指标，实验重复三次，取其平均值进行分析。
　　 （五）免疫杂交法检测PRDX2蛋白、H3乙酰化蛋白水平
　　 提取蛋白，电泳，PVDF膜转膜，BSA封闭。分别加入PRDX2、H3乙酰化抗体、β-actin鼠单克隆抗体，然后加入单克隆二抗，成像，采集数据。采用条带密度值与相应β-actin密度值的比值作为指标进行比较，实验重复三次，取平均值进行分析。
　　 实验结果：
　　 1、Real-time PCR显示AML组患者PRDX2 mRNA表达量明显下调;Western blot显示AML组患者PRDX2蛋白表达量同样较对照组下调。
　　 2、PRDX2启动子甲基化情况:55例AML患者中17例出现甲基化现象，启动子甲基化率为31％(17/55);40例对照组患者中0例出现甲基化现象，甲基化率为0％(0/40)。PRDX2基因甲基化与患者年龄、性别、分型等临床特征无关，与诊断分期有关。
　　 3、AML患者中甲基化组的基因mRNA表达要低于非甲基化组。
　　 4、AML组MNC细胞的乙酰化组蛋白H3表达低于对照组;AML组患者组蛋白H3乙酰化水平与PRDX2基因mRNA表达呈正相关。
　　 5、甲基化阳性组患者中组蛋白H3乙酰化水平较甲基化阴性组下降。
　　 结论：
　　 1、PRDX2基因在AML患者存在明显的表达下调。
　　 2、PRDX2基因启动子高甲基化是PRDX2表达失活的主要原因之一在AML的发生发展中起重要作用。PRDX2基因启动子甲基化检测可作为AML早期诊断、阶段评估的肿瘤标记物。
　　 3、急性髓细胞白血病患者的组蛋白乙酰化水平下降，组蛋白乙酰化水平对PRDX2基因差异表达具有调控作用。
　　 4、DNA甲基化与组蛋白去乙酰化在导致基因沉默的过程中是紧密联系，相互影响的。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 急性髓细胞白血病中PRDX2基因表达失活及临床意义的研究

前言

资料来源与研究方法

结果

讨论

结论

论文二 急性髓细胞白血病中PRDX2基因启动子高甲基化及其组蛋白乙酰化研究

前言

资料来源与研究方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

在学期间科研成绩

致谢

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