小鼠皮肤损伤愈合过程中PI3K/Akt的表达及其与损伤时间关系的研究

摘要

目的
　　皮肤损伤愈合是一个在时间和空间上受到一定细胞及细胞因子调控的连续而复杂的生物学过程，包括炎症期、纤维增生期和组织重建期，三个相互重叠但又具有不同特点的阶段。磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)，是一类特异性地催化磷酯酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)3位羟基磷酸化，并产生具有第二信使作用的肌醇脂物3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol3，4，5-triphosphate，PIP3)的激酶，可以募集和激活下游的靶蛋白蛋白激酶B(ProteinkinaseB，Akt)进而启动一系列信号联级反应，参与细胞生长、增殖、分化和凋亡的调节。本研究应用免疫组织化学染色、Westernblot及Real-timePCR技术，检测小鼠皮肤损伤区在损伤不同时间段PI3K/Akt及p-PI3K、p-Akt的表达及其表达变化规律，探讨在皮肤损伤愈合中PI3K/Akt的表达规律在推断皮肤损伤时间中应用的可能性。
　　实验材料与方法
　　健康成年（8周龄）清洁级昆明系小鼠50只，雄性，体质量35～40g，随机分为10组，每组5只，其中皮肤损伤组分为9个时间段，另1组为对照组。腹腔注射戊巴比妥钠，剃毛备皮、碘伏消毒后，内径6mm环形打孔器于小鼠背部、脊柱两侧对称处皮肤全层打2个孔。创面自然止血，不包扎，不施药，打孔后每只小鼠分笼饲养，给予消毒饲料及蒸馏水并保持创面干燥，防止创面感染，建立皮肤损伤动物模型。实验组小鼠分别于伤后不同时间段(1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、17d、21d)，腹腔注射2％戊巴比妥钠(350mg/kg)处死小鼠，取创口周围皮肤大小1.0cm×1.0cm，对照组小鼠取相同部位同等大小皮肤。创口中间切开分为两部分，一部分用于石蜡切片的HE染色、免疫组织化学染色;另一部分用于Westernblot和Real-timePCR。应用免疫组织化学染色技术检测50例小鼠皮肤损伤后各时间段PI3K、p-Akt蛋白的表达情况，以正常皮肤作对照，显微镜×400倍下，在损伤区及损伤周边区随机选取10个视野，计数阳性细胞率;应用ImageProPlus6.0图像分析软件分析所选视野，以积分光密度(integralopticaldensity，IOD)代表蛋白颗粒密度。Westernblot技术检测PI3K/Akt及p-PI3K、p-Akt的变化规律，应用全自动化学发光图像分析系统(Tanon5500)进行谱带分析和光密度值测定;Real-timePCR技术检测损伤区及其周边区PI3K、AktmRNA的表达情况。测得数据用均数±标准差（X(∧)±S）表示，用SPSS13.0forWindows进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果
　　正常小鼠皮肤组织中表皮细胞、毛囊、皮脂腺及皮肌层表达PI3K、p-Akt。皮肤损伤愈合过程中，PI3K、p-Akt在多核粒细胞、单个核细胞及成纤维细胞中表达。损伤后1d，PI3K、p-Akt表达以多核粒细胞为主;损伤后3～5d，PI3K、p-Akt表达以单个核细胞为主;损伤后7～21d，PI3K、p-Akt表达以成纤维细胞为主。PI3K阳性细胞率在损伤后1～5d逐渐升高，在损伤后5d达到峰值，损伤后7～21d略有下降。p-Akt阳性细胞率在损伤后1～7d逐渐升高，在损伤后7d，达到峰值，9～21d略有下降。阳性细胞率组间比较，P＜0.05，差异有统计学意义。Westernblot结果显示PI3K蛋白在损伤后1d表达略有下降;损伤后3～11d，表达逐渐升高，在损伤后11d达到峰值;损伤后13～21d表达逐渐降低。p-PI3K蛋白在损伤后1～3d表达逐渐升高，在损伤后3d达到峰值;损伤后5～21d，表达逐渐降低。其中损伤后1d，3d与对照组及其它损伤组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。Akt蛋白在损伤后1d表达略有下降;损伤后3～13d，表达逐渐升高，在损伤后13d达到峰值;损伤后17～21d，表达逐渐降低。p-Akt蛋白在损伤后1d表达达到峰值，随后表达逐渐降低。Westernblot结果组间比较，P＜0.05，差异有统计学意义。Real-timePCR结果显示，损伤愈合过程中，PI3KmRNA和AktmRNA表达水平呈规律性变化，损伤后1d，PI3KmRNA第一次达到峰值;损伤后3～5d略有下降;损伤后7～11d逐渐升高，在损伤后11d再次达到峰值;损伤后13～21d，表达逐渐下降。其中损伤后9d、11d，与对照组及其它损伤组相比较，P＜0.05，差异有统计学意义。AktmRNA产物水平在损伤后1～9d表达逐渐升高，在9d的时候达到峰值;损伤后11～21d表达逐渐下降。其中损伤后7d，9d，11d与对照组及其他损伤组相比较，P＜0.05，差异有统计学意义。
　　结论
　　1、正常小鼠皮肤组织中表皮细胞、毛囊、皮脂腺及皮肌层表达PI3K、p-Akt。
　　2、小鼠皮肤损伤愈合过程中，PI3K、p-Akt在多核粒细胞、单个核细胞及成纤维细胞中表达，其阳性细胞率变化具有时间规律性。
　　3、小鼠皮肤损伤愈合过程中p-PI3K、p-Akt在炎症期变化显著，PI3K/Akt在增殖期和组织重建期表达出现峰值;PI3K/Akt表达变化具有时间规律性，均可用于皮肤损伤时间推断。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

实验材料与方法

实验结果

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讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 PI3K／Akt在皮肤相关疾病及损伤中的作用

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