PDGFR信号通路与创伤性脑损伤后瘢痕形成的相关性研究

摘要

中枢神经系统(Central nervous system，CNS)损伤包括脑和脊髓的损伤，其发生原因可能有以下几种:如缺血、出血、创伤等。中枢神经损伤后可能会造成大量神经细胞的死亡和组织的破损，严重影响感觉、植物和运动神经的功能，更有甚者会导致残疾等严重后遗症，使病人的生活质量明显下降。因此，改善患者的生存质量成为目前国内外医学工作者的探索及研究热点。
　　中枢神经损伤后可引起软脑膜细胞增殖并侵入损伤部位，这些细胞可分泌如Ⅳ型胶原，纤粘连蛋白等从而形成纤维性瘢痕。在损伤周边的反应性胶质细胞增生并围绕损伤部位形成境界膜，这种反应被认为是中枢神经损伤后的免疫反应从而防止二次损伤的产生。由此在损伤部位周边和损伤部位之间形成神经组织和非神经组织的界限，也就是物理屏障（纤维性瘢痕）和损伤周边的化学屏障（胶质瘢痕），而神经纤维即使具有再生的能力也不易通过胶质瘢痕，更无法越过非神经组织区-纤维性瘢痕。
　　最先在血小板α颗粒中发现的一种细胞因子，即血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)，在多种间质细胞（如成纤维细胞、神经胶质细胞、单核细胞、内皮细胞、胚胎系膜细胞）均有表达。当组织受到损伤后，细胞合成的PDGF会通过自分泌和旁分泌的方式发挥其强促有丝分裂剂和趋化作用。血小板衍生生长因子受体(PDGFR)是属于酪氨酸蛋白激酶家族成员，其与配体PDGF结合后，能促使肌动蛋白重排和发挥促进细胞的趋化、分裂与增殖作用，主要是通过特异的酪氨酸残基磷酸化启动并放大信号而发挥作用，在机体生长发育、创伤修复等生理过程中起着重要的作用。PDGFRs控制许多信号通路，例如Ras-MAPK、PI3K和PLC-γ,这些都包含在多种细胞的生长发育过程中。PDGFRs与Ras-MAPK结合主要通过蛋白质适配器Grb2和Shc，Grb2通过它的SH2结构域结合活化的PDGFRs，免疫复合物SOS1通过它的SH3结构域反向活化Ras，导致下游的Raf-1和MAPK的激活。MAPK信号激活基因转录，从而对细胞生长、变异、迁移产生刺激。PI3K是磷酸肌酶磷酸化的酶类，PI3K信号的影响因素包括丝氨酸/苏氨酸激酶例如Akt/PKB，PKC家族的成员包括非典型的亚型，p70s6激酶、Jun氨基末端激酶和Rho家族的小GTP酶。PLC-γ结合PDGFRs并通过磷酸化活化起作用，PLC-γ活化促进细胞外钙离子的活化和PKC的活化。PDGFRs介导的PLC-γ活化包括刺激细胞的生长和维持细胞的活力。
　　已有数据表明在肾脏纤维化中通过PDGFRs活化PI3K通路可以促进肌纤蛋白重组，介导代谢调节，刺激细胞生长，抑制细胞凋亡。但目前尚缺少PDGFR是否也通过调控PI3K/Akt而发挥调节脑损伤后细胞的增殖与凋亡，进而影响瘢痕形成的相关研究。由于脑损伤后会有血脑屏障的破坏及血小板的溢出，而胶质瘢痕是由于胶质细胞过度增多形成，纤维瘢痕是由于成纤维细胞过度增殖形成。因此我们设想，此信号转导通路是否与纤维性瘢痕和胶质性瘢痕的产生有相关性。
　　目的:本实验拟通过体内外脑损伤模型证明PDGFR信号转导通路在纤维性瘢痕和胶质性瘢痕产生中的作用，同时应用PDGFR的抑制物如AG1296阻止信号的转导来探讨中枢神经损伤后减少瘢痕形成从而促进神经再生的可能性。此研究可进一步阐明中枢神经损伤后的阻碍神经再生机制，从而发现促进神经再生的途径，进而为临床治疗中枢神经损伤包括脊髓损伤提供坚实的理论基础，在现实生活中具有重要的指导意义及应用价值。
　　方法:1、8周龄BALB/c小鼠建立黑质纹状体损伤模型，观察p-PDGFRs在脑损伤周边的经时表达及细胞定位。用免疫组织化学染色和Western Blot检测p-PDGFR-α/β在脑损伤周边的经时表达变化;运用免疫荧光双标法检测p-PDGFR-α/β的细胞定位表达。2、注射AG1296后，观察PDGFR信号通路相关蛋白在损伤周边表达的变化，检测损伤部位瘢痕组织的变化情况。用免疫组织化学染色和Western Blot检测给予抑制剂与否p-PDGFR-α/β，GFAP，IBA-1在损伤周边的变化;运用免疫组织化学染色法比较给予抑制剂与否NG2，CD45，FN，ColⅣ表达的变化;应用Western Blot检测给予AG1296与否p-Akt在损伤周边的变化。3、1-3天BALB/c小鼠脑星形胶质细胞和软脑膜成纤维细胞共培养检测体外损伤模型瘢痕形成与PDGFR信号通路的相关性。通过向共培养细胞体系加入细胞因子PDGF-BB和抑制剂AG1296前后运用免疫组织化学染色及MTT方法检测细胞数量的变化，Western Blot检测p-PDGFR-α/β，p-Akt表达的变化。
　　结果:1、p-PDGFRs在损伤周边的经时表达和定位。免疫组化结果:p-PDGFRs表达位于细胞的胞浆，成棕黄色为阳性表达。伤后1d，p-PDGFRα围绕在损伤的周围，4d时聚集在损伤中央并且表达最多达高峰，7d时表达逐渐减少，到14d时表达更少。伤后1d，p-PDGFRβ围绕在损伤的周围，4d时表达逐渐增多，7d时聚集在损伤中央并且表达最多达高峰，到14d时表达减少。而在假手术组，几乎见不到两种受体表达。Western Blot结果:假手术组，p-PDGFRs表达微弱，损伤后1d开始增多，p-PDGFRα在4d表达最多，p-PDGFRβ在7d表达最多，随后逐渐减弱，与免疫组化结果一致。免疫荧光双重染色结果显示p-PDGFRα/β均表达在GFAP阳性的星形胶质细胞，IBA-1阳性的小胶质细胞，NG2阳性的少突胶质细胞祖细胞，CD45阳性的粒细胞。2、注射AG1296后，PDGFR信号通路相关蛋白在损伤周边表达的变化，损伤部位周边的瘢痕表达情况的变化:免疫组织化学染色及Western Blot结果均显示GFAP阳性反应的星形胶质细胞，IBA-1阳性反应的小胶质细胞在损伤后1，4，7，14d给予抑制剂AG1296组细胞增殖较未给予抑制剂组明显减少(p＜0.05)。免疫组织化学染色结果显示损伤后14d时CD45，NG2，ColⅣ，FN给予抑制剂组表达较未给予抑制剂组减少(p＜0.05)，瘢痕形成减少。通路关键蛋白表达结果显示p-PDGFRα/β，p-Akt给予抑制剂组表达较未给予抑制剂组明显减少(p＜0.05)，说明AG1296可通过抑制PDGFR-Akt通路而发挥抑制瘢痕形成的作用。3、体外损伤模型瘢痕形成及PDGFR信号通路蛋白表达的变化:免疫组织化学染色及MTT结果均显示加入PDGF-BB后星形胶质细胞和成纤维细胞增殖均比对照组多(p＜0.05);给予抑制剂后增殖受到抑制(p＜0.05)。Western Blot结果显示加入PDGF-BB后p-PDGFRα/β，p-Akt表达增多(p＜0.05);给予抑制剂后表达减少(p＜0.05)。进一步验证了体内实验结果:AG1296可通过抑制PDGFR-Akt通路而发挥抑制瘢痕形成的作用。
　　结论:1、活化的PDGFRs与星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞和粒细胞的增殖有关。2、给予AG1296后胶质细胞、成纤维细胞和粒细胞增殖减少，瘢痕组织减少。3、加入PDGF-BB后共培养细胞增殖明显增多，这种体外共培养体系可以为研究瘢痕形成机制提供实验基础。4、应用AG1296后，p-PDGFRs，p-Akt的表达明显下降，提示AG1296具有抑制PDGFR-PI3K/Akt信号通路，并减少瘢痕组织形成的作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：p-PDGFRs在黑质纹状体损伤周边的经时表达和定位的研究

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 主要研究对象和分组

3 实验结果

3．1 Western blotting检测p-PDGFRs蛋白的表达

3．2 免疫组化检测p-PDGFRα／β在脑损伤后不同时间的表达

3．3 p-PDGFRs蛋白的定位表达

4 讨论

5 结论

第二部分：抑制PDGFR信号通路对脑损伤后瘢痕形成的影响

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 主要研究对象和分组

3 结果

3．1 Western blotting结果

3．2 免疫组织化学染色结果

4 讨论

5 结论

第三部分：建立体外模型探讨PDGFR信号通路与瘢痕形成的相关机制研究

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 主要研究对象和分组

3 结果

3．1 形态学检测结果

3．2 MTT比色法分析细胞活力

3．3 Western blotting结果

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 PDGFR信号通路在神经系统中与细胞增殖的相关性

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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