微小RNA-125A-5p在头颈鳞癌中的表达及其在头颈鳞癌细胞增殖、侵袭、转移的作用研究

摘要

目的:
　　头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是发生在头颈部区域发病率最高的恶性肿瘤，数据显示约50％的患者明确诊断时就处于疾病的晚期。而相关研究表明，HNSCC患者（特别是局部晚期患者）淋巴结转移是影响其预后的关键因素之一，所以探索HNSCC患者的淋巴结转移机制对疾病的治疗工作具有重要的意义，有助于对HNSCC的预防及诊治。
　　C-C型趋化因子受体7(CCR7)是一种重要的趋化因子的，属于趋化因子C-C的亚型，在多种肿瘤细胞表面均有表达，如白血病、淋巴瘤，淋巴增生综合征以及一些上皮源性的恶性肿瘤。通过与其配体21(CCL21)和19(CCL19)共同作用促进肿瘤迁移和淋巴结转移。本课题组以往研究结果与其他相关研究成果共同表明，CCR7可通过多种信号传导途径作用于头颈部鳞状细胞癌的侵袭和转移。
　　此外，我们将构建hsa-miR-125a-5p过表达真核质粒，并转染PCI-37B细胞，通过体外细胞功能实验及PCI-37B细胞中hsa-miR-125a-5p对CCR7表达影响的检测，来探讨hsa-miR-125a-5p在头颈部鳞癌中的作用。最终能够初步阐明hsa-miR-125a-5p表达在HNSCC中作用和意义，并为hsa-miR-125a-5p作为HNSCC的治疗靶点提供参考依据。
　　方法:
　　1、细胞系和细胞培养
　　HNSCC的PCI-37B细胞系具有较强的侵袭和转移能力，并能够明显表达CCR7蛋白，该细胞系由匹兹堡大学肿瘤研究所惠赠。细胞生长在含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液中，于37℃、5％ CO2饱和湿度条件下进行培养。细胞汇合80％时用0.25％胰蛋白酶消化。
　　2、质粒的构建及细胞转染
　　设计构建miR-125a-5p真核过表达质粒，转染PCI-37B细胞，并用RT-PCR检测转染细胞中是否成功过表达miR-125a-5p基因。
　　3、总RNA提取和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应
　　高纯度总RNA快速提取试剂盒用于分离提取细胞和组织样本的总RNA，qRT-PCR法检测miR-125a-5p与参考基因U6的表达。采用相对定量的模式对三重复试验测量的数据进行处理。
　　4、CCK-8实验，Transwell实验和划痕实验检测细胞转染前后增殖、侵袭及迁移能力的变化
　　在96孔板中培养转染前后的三组细胞。当到达特定的时间时加入10μl CellCounting Kit-8(CCK-8)，用酶标仪在450 nm处测定OD值，对数据进行分析，判断细胞增殖的变化。
　　Transwell细胞侵袭实验中将事先铺好Matrigel胶膜的小室放入24孔板。下室添加800μL含20％ FBS的DMEM培养液;将200μl细胞悬液加入到上室，细胞数量为2×104/孔。细胞培养24 h后显微镜观察并计数侵袭至胶膜下的细胞。分别选取各个样本中5个视野并取它们的平均数。
　　3组细胞更换为无血清培养基含1μg/mL丝裂霉素C。细胞划痕是由200μl移液管尖部制作。在0h、6h、12h、24 h分别通过显微镜观察并拍照记录细胞的位置，计算每个组的迁移距离。Transwell细胞迁移实验中将小室放入24孔板。下室添加800μL含20％ FBS的DMEM培养液;将200μl细胞悬液加入到上室，细胞接种数量为2×104/孔。培养24 h显微镜计数迁移至下室的细胞。分别选取各个样本中5个视野并取它们的平均数。共同检测细胞的迁移能力。
　　5、蛋白提取及Western blot检测
　　利用总蛋白提取试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒提取总蛋白并测定其浓度。Western Blot实验以内参抗体β-actin和CCR7抗体分别为一抗，并以羊抗兔IgG-HRP为二抗，分析CCR7的表达。凝胶图像处理系统扫描目标条带，并对条带灰度进行分析。
　　6、病例及标本
　　收集2014年8月～2016年5月于中国医科大学附属口腔医院口腔颌面-头颈外科接受手术治疗、并经病理明确诊断为鳞状细胞癌的30例患者肿瘤原发灶和癌旁非肿瘤组织，组织离体后短时间内用液氮冷冻并保存。所有患者及家属均在标本收集前签署知情同意书。
　　7、生存分析
　　在TCGA数据库中下载头颈鳞癌患者的临床数据信息以及患者相应的hsa-miR-125a-5p表达谱数据。高通量测序平台BCGSC IlluminaGA miRNASeq和BCGSC IlluminaHiSeq miRNASeq中（最终数据下载日期:2014年6月20日）共有397名患者，同时具有microRNA表达谱数据以及临床生存数据，我们使用这397个病例的hsa-miR-125a-5p表达谱数据及临床数据进行后续分析。
　　8、统计分析
　　所有实验数据均通过至少三个独立重复实验获得，表示为x±s，组间差异采用方差分析进行检验。生存数据矩阵分析hsa-miR-125a-5p表达与肿瘤分期和生存时间之间的关系。Kaplan-Meier(K-M)总体生存曲线差异的显著性用Log Rank检验。结果数据运用SPSS17.0及Graphpad Prism5.0分析及绘图，以P＜0.05作为有统计学意义的标准。
　　结果:
　　1、miRNA-125a-5p过表达对HNSCC细胞中趋化因子受体7及细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响
　　(1)qRT-PCR检测质粒转染前后的PCI-37B细胞表明:阳性转染组细胞miRNA-125a-5p的表达显著高于其他两对照组(p＜0.01)。说明miRNA-125a-5p过表达质粒转染成功。
　　(2)Western blot实验检测过表达质粒转染所得的PCI-37B细胞中CCR7蛋白表达，电泳条带的灰度分析表明:PCI-37B miR-125a-5p+组细胞CCR7蛋白表达显著高于空白对照组PCI-37B细胞和阴性转染组PCI-37B miR-125a-5p-细胞(p＜0.01)。说明miRNA-125a-5p与CCR7之间存在正向调控关系。
　　(3)CCK8实验检测转染前后三组PCI-37B细胞在不同时间点的450 nm OD值变化，统计结果表明37BmiR-125a-5p+组在各时间点生存细胞数显著高于其他两对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。即PCI-37B中过表达miRNA-125a-5p能够显著提高肿瘤细胞的增殖能力。
　　(4)在Transwell侵袭实验中，三组细胞转染前后侵袭能力变化的结果提示:PCI-37B细胞阳性转染组的侵袭能力明显强于其他两对照组，差异存在统计学意义(p＜0.05)。结果提示过表达miRNA-125a-5p能够明显增强PCI-37B的侵袭能力。
　　(5)Transwell迁移实验的结果显示PCI-37B细胞阳性转染组的迁移能力显著强于空白对照组及阴性转染组，差异存在统计学意义(p＜0.05)。细胞划痕实验对每个时间点细胞迁移情况的分析结果提示，过表达miRNA-125a-5p的PCI-37B细胞迁移率在各时间点均高于其他两对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。说明PCI-37B细胞中过表达miRNA-125a-5p，能够显著提高癌细胞的迁移能力。
　　2、miRNA-125a-5p在头颈鳞癌组织中表达的临床意义
　　(1)荧光定量PCR检测HNSCC原发灶组织和相应癌旁正常组织miRNA-125a-5p的表达量，结果显示头颈鳞癌原发灶中miRNA-125a-5p表达量与相应癌旁正常组织存在明显差异。
　　(2)对不同临床分期患者miRNA-125a-5p的表达值进行分析，检验结果表明在Ⅲ&Ⅳ期患者中miRNA-125a-5p表达值显著低于Ⅰ&Ⅱ期患者miRNA-125a-5p表达值(P＜0.05)
　　(3)根据患者生存时间数据绘制K-M生存曲线，结果显示miRNA-125a-5p低表达组患者预后生存时间较长。Log-Rank检验结果提示两组样本生存时间之间的差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1、构建miRNA-125a-5p真核过表达质粒，通过荧光定量PCR检测，成功转染头颈部鳞状细胞癌PCI-37B细胞系。并通过Western Blot检测过表达miRNA-125a-5p后PCI-37B细胞，结果显示CCR7蛋白的表达量显著升高，说明二者之间存在正向调控关系。
　　2、相关功能实验结果提示，与空白对照组和阴性转染组PCI-37B细胞相比，过表达miRNA-125a-5p的PCI-37B细胞增殖、侵袭、迁移方面的能力均显著增强，提示过表达的miRNA-125a-5p具有增强头颈部鳞癌恶性生物学行为的作用。
　　3、miRNA-125a-5p在HNSCC组织及癌旁非肿瘤组织中的表达量存在差异。印证了细胞功能学实验的结果，对HNSCC临床诊断具有一定参考意义。miRNA-125a-5p的表达水平也与HNSCC的肿瘤临床分期显著相关，并且与HNSCC患者生存时间之间存在一定的相互关系，表明miRNA-125a-5p的差异表达可能在HNSCC发生和发展的分子机制中存在重要作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 过表达miRNA-125a-5p对头颈鳞癌细胞系中趋化因子受体7表达及细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 miRNA-125a-5p在头颈鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 MicroRNA125a-5p与恶性肿瘤相关性的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简历