初次RSV感染时间影响成年期再次感染时γδT细胞介导的气道炎症

摘要

目的：
　　婴幼儿期严重RSV感染与儿童及成年期哮喘密切相关。研究发现，与初次RSV感染发生在成年期小鼠相比，初次感染发生在新生期的小鼠成年期再次感染引起更为严重的全身症状和气道炎症，提示初次RSV感染时间决定再次感染时的疾病严重程度，但新生期初次RSV感染通过何种机制影响成年期再次感染时气道炎症反应目前尚不十分清楚。
　　呼吸道黏膜系统的γδT细胞位于免疫防御第一道防线，在呼吸道黏膜局部抗感染免疫及免疫调节方面起作用。在抗感染免疫的初次应答中，γδT细胞可因抗原性质的不同而分泌不同类型的细胞因子，进而调控免疫应答的类型。我们前期研究工作亦发现，致敏前RSV感染明显降低致敏鼠肺组织γδT细胞数量，并伴随Th2型细胞因子及血清特异性IgE，IgG1水平的下降，推测γδT细胞及其所分泌的细胞因子在RSV感染所致肺组织炎性病变及喘息发作方面起重要作用。然而，γδT细胞在初次RSV感染发生在新生期，成年期再次感染所诱发的气道炎症反应中具有怎样的生物学作用及其作用机制如何，目前尚不清楚。本研究利用初次RSV感染发生在不同年龄段，再次感染发生在成年期的模型鼠，探讨在初次RSV感染时间对再次感染后气道炎症发生发展影响过程中，γδT细胞的作用以及免疫应答调控机制，为揭示新生期初次RSV感染与儿童期哮喘的相关性以及进一步理解γδT细胞在哮喘发生发展中的作用提供实验依据。
　　方法：
　　一、实验材料
　　1、主要试剂
　　PBS、Diff-Quick染液、HE染液、PAS染液、胶原酶D(Sigma)、Dnsae I(Sigma)、水合氯醛、胎牛血清(TBD)、胰酶、青霉素、链霉素、红细胞裂解液、小鼠淋巴细胞分离液(TBD)、4％多聚甲醛、ELISA试剂盒(R&D)、real-timeRT-PCR试剂盒（Takara）、总RNA提取试剂盒(Takara)、逆转录试剂盒（Takara）、磁珠抗体(Miltenyi)、流式抗体FITC anti-TCRγ/δ mAb、APC anti-CD3 mAb、PE/Cy7 anti-CD69 mAb及PE anti-IFN-γ/IL-4/IL-5/IL-13 mAb(BioLegend)。
　　2、病毒
　　用Hep-2细胞增殖人类呼吸道合胞病毒A2型(RSV A2)，采用30％蔗糖超速离心法分离病毒粒子，少量分装，-80℃冰箱保存。RSV病毒滴度用组织细胞半数感染量(50％ Tissue culture infections dose，TCID50)表示。
　　二、试验方法
　　1、实验动物模型
　　将购于北京华阜康生物科技股份有限公司的6-8周BALB/c鼠在本校实验动物中心繁殖饲养。本实验共设4组，组①:正常对照组（表示为:Mock）。对应时间点给予相同剂量PBS;组②:成年期一次RSV感染组（表示为:Adult1°）。于出生后第8周用20μl含2×106 TCID50的RSV病毒悬液经鼻感染小鼠;组③:成年期初次RSV感染，成年期再次感染组（表示为:Adult2°）。于出生后第4周用20μl含2×106 TCID50的RSV病毒悬液经鼻感染小鼠，第8周用20μl含2×106TCID50的RSV病毒悬液经鼻再次感染小鼠;组④:新生期初次RSV感染，成年期再次感染组（表示为:Neonatal2°）。于出生后第1周用10μl含2×105 TCID50的RSV的病毒悬液经鼻感染小鼠，第8周用20μl含2×106 TCID50的RSV的病毒悬液经鼻再次感染小鼠。去除γδ T细胞实验:新生期初次RSV感染鼠，于成年期再次RSV感染前1天及感染后第2、3天，分别经鼻粘膜给予10μg anti-TCRδ mAb[10，18]。
　　2、小鼠肺组织单细胞悬液制备
　　腹腔注射7.2％水合氯醛深度麻醉小鼠，经心脏灌流20ml无菌PBS以去除血管内血细胞后取肺组织。用10ml含有collagenase D(200μl10mg/ml)和DNaseⅠ(40μl10mg/ml)的10％ FBS RPMI-1640消化处理肺组织，淋巴细胞分离液分离肺组织淋巴细胞。
　　3、肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluids，BALF)炎性细胞分类与计数
　　用含有1ml PBS的注射器经支气管冲洗肺组织，收集肺泡灌洗液。离心后收集上清，用于检测细胞因子水平。100μl PBS重悬细胞沉淀，计数细胞总数并制备细胞涂片。Diff-Quick染色后显微镜下随机选择视野，计数200个细胞，依据形态学特点分别计数中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞数量。
　　4、肺组织病理标本制作及染色
　　取模型鼠肺组织浸泡于4％多聚甲醛中固定48小时后，梯度乙醇逐级脱水，随后经过石蜡包埋、切片后进行HE染色，光学显微镜观察模型鼠肺组织形态结构及炎症反应情况。
　　5、细胞因子mRNA水平的检测
　　用RNAiso plus试剂盒提取肺组织总RNA，PrimeScript TM逆转录试剂盒合成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明，采用Real-time RT-PCR技术检测肺组织局部Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表达水平。
　　6、细胞因子蛋白检测
　　按照ELISA试剂盒说明，定量测定肺胞灌洗液中Th1型细胞因子γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)，Th2型细胞因子白细胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）、白细胞介素-5（Interleukin-5，IL-5）和白细胞介素-13（Interleukin-13，IL-13）的蛋白含量。
　　7、流式细胞术检测γδ T细胞
　　调整小鼠肺组织淋巴细胞浓度，加入FITC anti-TCRγ/δ mAb、APC anti-CD3mAb及PE/Cy7 anti-CD69 mAb(BioLegend)，避光，4℃孵育30分钟。2％ FBS-PBS洗涤两次，300μl2％ FBS-PBS重悬细胞，上机检测。
　　8、流式细胞术检测γδ T细胞内细胞因子
　　细胞经表面染色后，2％ FBS-PBS洗涤一次;向细胞悬液中加入2μl/ml的CellActivation Cocktail(BioLegend)，37℃5％ CO2培养箱孵育1h后，加入2μM蛋白转运抑制剂(Monensin)，继续孵育4h。2％ FBS-PBS洗涤两次，加入250μlFixation and Permeabilization Solution(BD)，避光，4℃孵育20分钟。Perm/WashBuffer(BD)和2％ FBS-PBS洗涤后，加入PE标记的细胞因子抗体(IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13)或同种型抗体，避光，4℃孵育30分钟。2％ FBS-PBS洗涤两次，300μl2％ FBS-PBS重悬细胞，上机检测。
　　三、统计学分析
　　所有数据采用GraphPad Prism5软件进行统计学分析。实验结果以均值±标准差（X±S）表示。组间比较采用ANOVA进行统计分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果：
　　1、新生期初次RSV感染加重成年期再次感染时的气道炎症
　　为了探究初次RSV感染时间对再次感染时气道炎症的影响，出生1周的新生鼠或4周的成年鼠经鼻感染RSV，所有小鼠在第8周再次经鼻感染RSV。HE染色发现与初次RSV感染发生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染发生在新生期，成年期再次感染后，肺组织细支气管周围出现明显的炎性细胞浸润，肺泡灌洗液中炎性细胞总数明显增加，其中以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及中性粒细胞数量增加尤为显著，提示新生期初次RSV感染加重成年期再次感染时所诱发的气道炎症。
　　2、新生期初次RSV感染增加成年期再次感染鼠肺组织局部Th2型细胞因子水平
　　采用ELISA法定量检测模型鼠肺泡灌洗液中Th1/Th2型细胞因子的蛋白水平。结果发现，与初次RSV感染发生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染发生在新生期，成年期再次感染后，肺泡灌洗液中Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13明显升高，而Th1型细胞因子IFN-γ水平没有明显改变。
　　利用Real-time RT-PCR技术检测模型鼠肺组织Th1型细胞因子IFN-γ，Th2型细胞因子IL-4、IL-5及IL-13 mRNA表达量。结果发现，与初次RSV感染发生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染发生在新生期，成年期再次感染后，肺组织局部Th2型细胞因子IL-4、IL-5及IL-13 mRNA的表达显著增加，而Th1型细胞因子IFN-γ水平明显降低，推测新生期初次RSV感染通过影响Th2型细胞因子的水平左右成年期再次感染时的气道炎症。
　　3、新生期初次RSV感染增加成年期再次感染鼠肺组织局部γδ T细胞及活化γδ T细胞数量
　　利用流式细胞术检测模型鼠肺组织γδ T细胞总数及其活化的γδ T细胞（细胞表面标记为:CD69+γδ T）数量。结果显示，与初次RSV感染发生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染发生在新生期，成年期再次感染后，肺组织局部γδ T细胞总数以及活化的γδ T细胞的百分比和细胞数均明显增加。
　　4、新生期初次RSV感染增加成年期再次感染鼠肺组织内Th2型γδ T细胞数量
　　通过流式细胞术分析模型鼠肺组织局部分泌Th1/Th2型细胞因子的γδ T细胞数量。结果发现，与初次RSV感染发生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染发生在新生期，成年期再次感染后，分泌Th2型细胞因子的γδ T细胞，如IL-4+γδT细胞、IL-5+γδ T细胞、IL-13+γδ T细胞数量明显增加，然而分泌Th1型细胞因子的γδ T细胞，如IFN-γ+γδ T细胞数量却显著降低，提示新生期RSV感染通过增加肺局部Th2型γδ T细胞数量影响再次RSV感染时所诱发的气道炎症。
　　5、新生期初次RSV感染通过影响γδ T细胞生物学功能左右成年期再次感染时所诱发的气道炎症
　　为进一步明确新生期初次RSV感染通过增加成年期再次感染鼠肺组织内Th2型γδT细胞数量，进而加重气道炎症，我们利用新生期初次RSV感染鼠，于成年期再次感染的前1天，感染后第2天和第3天经鼻粘膜给予anti-TCRδ mAb以去除γδ T细胞。结果显示，与对照组相比，anti-TCRδ mAb处理组小鼠肺组织细支气管周围炎性细胞浸润明显减轻，肺泡灌洗液中炎性细胞数量明显降低，其中嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量降低尤为显著，同时伴有Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平明显降低，而Th1型细胞因子IFN-γ水平没有明显改变，提示新生期初次RSV感染通过影响肺组织局部γδ T细胞生物学活性和功能，调控成年期再次感染时所诱发的气道炎症。
　　结论：
　　新生期初次RSV感染通过增加肺组织局部Th2型γδT细胞数量，以及增强其Th2型细胞因子分泌活性，加重成年期再次感染时所诱发的气道炎症。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述 固有免疫细胞在RSV感染中作用的研究进展

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