声明
摘要
英文缩略语
1 前言
2.1.1 实验用细胞
2.1.2 主要试剂
2.1.3 实验仪器
2.1.4 耗材
2.2 实验方法
2.2.1 Ag85A编码基因和突变体基因
2.2.2 Ag85A及突变体Ag85A-M的mRNA二级结构分析
2.2.3 全基因合成技术路线
2.2.4 拆分小片段策略
2.2.5 引物的溶解
2.2.6 分段延伸
2.2.7 单段PCR扩增
2.2.8 单段插入片段(Insert)制作
2.2.9 单段克隆
2.2.10 PCR扩增单段基因
2.2.11 PCR扩增全长基因
2.2.12 全长片段加A
2.2.13 全长克隆测序、双酶切
2.2.14 细胞复苏
2.2.15 细胞培养
2.2.16 细胞基因组DNA的提取
2.2.17 DC2.4细胞系的质粒转染
2.2.18 细胞系构建流程
2.2.19 CRISPR/Cas9技术ROSA26位点基因敲进Ag85A(M)技术路线
2.2.20 打靶策略
2.2.21 引物设计
2.2.22 PCR反应条件
2.2.23 定量PCR引物设计
2.2.24 实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)
2.2.25 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
2.2.26 蛋白免疫印迹(Western blot)
2.2.27 流式细胞术
2.2.28 统计学结果分析
3 结果
3.1 DC2.4细胞系的质粒转染
3.2 编码Ag85A基因突变体的设计分析
3.3 编码Ag85A基因突变体的人工合成
3.3.1 A、B、C、D和E片段合成
3.3.3 pIRES2-EGFP-Ag85A(M)载体EcoR I/BamH Ⅰ双酶切
3.3.4 三片段拆分法与两片段拆分法合成效率
3.3.5 pET28a-Ag85A(M)原核表达
3.4 采用CRISPR/Cas9技术ROSA26位点Ag85A突变基因敲进DC2.4 细胞系的建立
3.4.1 对ROSA26位点靶序列的PCR鉴定
3.4.2 Cas9/sgRNA的活性检测
3.4.3 打靶载体构建
3.4.4 打靶载体图谱
3.4.5 打靶质粒酶切鉴定
3.4.6 PCR法阳性单克隆鉴定
3.4.7 插入位点检测
3.5 Ag85A编码基因及突变体基因表达
3.6 RNA传感器及适配子的表达水平检测
3.6.2 黑色素瘤分化相关基因5(Mda-5)的表达水平
3.6.3 线粒体抗病毒信号转导蛋白(MAVS)的表达水平
3.6.4 干扰素调节因子3(IRF3)的表达水平
3.6.5 干扰素调节因子7(IRF7)的表达水平
3.6.6 Ⅰ型干扰素β(IFNβ)的表达水平
3.6.7 主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)的表达水平
4 讨论
5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述 RNA传感器RLRs家族研究新进展
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历
中国医科大学;