植物防御素的生物信息学分析及葡萄防御素基因的克隆

摘要

本文利用公共数据库数据，采取生物信息学的理论和方法，对植物防御素基因进行预测和序列分析。同时，着重对葡萄中预测出的防御素基因进行多方面的的研究并在此基础上进行基因克隆，为其后续的功能研究和大规模生产应用提供理论基础，也为利用生物信息学方法深入研究其他基因家族提供新的思路。本文主要的研究结果如下： (1)用已知的9种植物防御素基因作对照，根据DFCI数据库中28种植物的相关数据，进行同源性比对和开放阅读框分析，在24种植物中预测出115种新的植物防御素基因。对这些防御素基因进行信号肽的预测、氨基酸序列比对和运用NJ算法绘制进化树，结果发现所预测出的防御素基因大多具备信号肽序列，全部具备与植物防御素相同的保守序列，并按同源性可以被分成两个大类，这表明：它们与已知的植物防御素具有很高的同源性，具备植物防御素的基本特征。 (2)对预测出的葡萄4种植物防御素基因运用生物信息学的方法和工具对其核酸和氨基酸序列进行进一步分析，对它们的组成成分、翻译后修饰、信号肽、疏水性/亲水性、跨膜结构域、蛋白质二级结构预测和功能结构域的预测和推断表明：3种葡萄防御素是具有信号肽的分泌型蛋白，1种为不具信号肽的蛋白：α-螺旋和不规则的卷曲是葡萄防御素整体结构中的主要构成元件，β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中；都具备一个γ-硫堇结构域。 (3)将4种葡萄防御素与确定的拟南芥防御素进行进化分析，发现所有4种葡萄防御素都与拟南芥防御素2家族相近；分析4种植物防御素的基因组信息，发现3种含信号肽的防御素各具备一个内含子，且与拟南芥防御素2家族同源性较低。同时在NCBI上的电子表达谱分析，认为它们可能在多种葡萄器官中表达。 (4)用PlantCARE分析比较2种葡萄防御素的启动子，发现它们都具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box，均含有真菌诱导元件Box-W1及与防御和胁迫相关的作用元件TC-rich repeats，而其中一个葡萄防御素还包含与水杨酸相关的作用元件TGA-element，与脱落酸相关的作用元件ABRE，与茉莉酸甲酯相关的作用元件CGTCA-motif和TGACG-motif。 (5)根据生物信息学的预测与分析，成功克隆出3种葡萄防御素基因。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第二章植物防御素的研究进展概述

2.1植物防御素的结构特点及分类

2.1.1植物防御素的氨基酸组成

2.1.2植物防御素的空间结构

2.1.3植物防御素的分类

2.2植物防御素的合成及表达

2.2.1植物防御素的生物合成

2.2.2植物防御素的表达及调控

2.3植物防御素的产生机理和作用机制

2.3.1植物防御素的产生机理

2.3.2植物防御素的作用机制

2.4拟南芥中的植物防御素

2.5植物防御素的基因工程研究

第三章植物防御素基因的预测和序列分析

3.1数据的获得方法

3.2结果与讨论

3.2.1植物中预测出的防御素基因特征

3.2.2植物防御素的信号肽分析

3.2.3植物防御素基因间的氨基酸序列比对

3.2.4不同植物间防御素的进化关系

第四章葡萄防御素的生物信息学分析

4.1分析方法

4.2结果与讨论

4.2.1葡萄防御素核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的组成和理化性质

4.2.2葡萄防御素氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测

4.2.3信号肽的预测和分析

4.2.4葡萄防御素氨基酸序列疏水性/亲水性的预测和分析

4.2.5不同葡萄防御素跨膜结构域的预测和分析

4.2.6葡萄防御素的二级结构预测

4.2.7葡萄防御素功能结构域分析

4.2.8葡萄防御素的基因组信息

4.2.9四种葡萄防御素的电子表达谱分析

4.2.10葡萄防御素与拟南芥防御素氨基酸序列的同源性比较

4.2.11葡萄防御素与拟南芥防御素2家族的内含子序列比较

4.2.12葡萄防御素启动子分析

第五章葡萄防御素的克隆

5.1实验材料

5.1.1植物材料

5.1.2主要药品

5.1.3主要试剂及溶液配制

5.1.4主要仪器

5.2实验方法

5.2.1葡萄各器官RNA提取

5.2.2 RNA的纯化

5.2.3 DNA的消化

5.2.4 RNA反转录成cDNA

5.2.5引物设计：

5.2.6 PCR扩增

5.2.7凝胶回收

5.2.8连接反应

5.2.9大肠杆菌感受态的制备

5.2.10转化反应

5.2.11菌液PCR

5.2.12质粒的提取

5.3结果与讨论

5.3.1 RNA提取

5.3.2 PCR结果

5.3.3转化的平板

5.4.4测序结果

5.4.5质粒提取结果

第六章全文总结

参考文献

附录

致谢