FUT8-siRNA可减轻TGF-β1对体外培养的肾小管上皮细胞—肌成纤维细胞转分化的影响

摘要

目的：研究α-1，6岩藻糖基转移酶（α-1，6 fucosyltransferase，FUT8）在TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞（Human kidney-2，HK-2）-肌成纤维细胞转分化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）中的作用。 方法：将体外培养的HK-2细胞随机分为三组：①（CON组）对照组常规培养；②（TGF组）：加入浓分别为（5、10、20、40）ng/ml的TGF-β1刺激细胞；③（TGFF组）：使用siRNA干扰技术沉默细胞的FUT8基因，随后再加入20ng/mlTGF-β刺激细胞。前期工作中，我们合成了荧光素标记的FUT8-siRNA并瞬时转染HK-2细胞，使用倒置荧光显微镜检测siRNA的转染效率；PT-PCR及FUT8免疫荧光技术分别检测FUT8-siRNA基因沉默效果及蛋白抑制率。刺激细胞72小时后，观察各组细胞形态学改变；分别使用westernblot及免疫荧光技术检测细胞总FUT8蛋白及其底物α-1，6岩藻糖链的表达情况；此外使用免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）结合凝集素印迹检测特异性结合在TGF-βⅠ/Ⅱ型受体ALK-5（type Ⅰreceptoractivin-likekinase5）及TGF-βRⅡ（TGF-βtypeⅡreceptor）上的岩藻糖链的表达；使用免疫荧光技术共染FUT8、ALK5进一步验证两者的定位及表达；随后，使用westernblot及免疫组化染色技术对P-smad2/3进行评估；而α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smoothmuscleactin，α-SMA）也使用免疫组化染色进行评估。 结果：RT-PCR及westernblot检测结果显示FUT8-siRNA在100nM浓度下成功干扰HK-2细胞中FUT8基因及蛋白水平的表达，且转染效率达90%。使用相差显微镜观察CON组细胞呈正常地上皮细胞铺路石样形态；TGF组细胞发生明显的形态学改变，可见细胞肥大、拉长，提示发生成纤维化改变；而TGFF组可以一定程度的抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞形态的改变。与CON组相比，TGF组FUT8总蛋白表达升高（P<0.05），而其底物岩藻糖链并无显著的变化（P>0.05）；TGFF组与TGF组相比，FUT8蛋白（P<0.01）及其底物岩藻糖链（P<0.05）表达都降低。IP结合凝集素印迹显示特异性结合在TGF-βRⅡ的岩藻糖链的表达情况，TGF组与CON组相比表达上调（P<0.05），而TGFF组与TGF组相比明显下调（P<0.01）；以上变化趋势与ALK5结合的岩藻糖链的变化相同；并且使用荧光共聚焦显微镜进一步证实了ALK5与FUT8两者共表达，并且表达位点完全重合。TGF组呈剂量依赖性上调P-smad2/3表达（P<0.05）；而TGFF组与TGF组比较，FUT8-siRNA可以阻断其上调（P<0.05）；同样，α-SMA免疫组化结果显示TGF-β1可剂量依赖性上调其表达（P<0.05），而可以被FUT8-siRNA所阻断（P<0.05）。 结论：1.FUT8-siRNA能够下调HK-2细胞ALK5、TGF-βRⅡ的岩藻糖基化水平；2.抑制TGF-βRⅠ、RⅡ的岩藻糖基化修饰能够抑制其下游P-smad2/3活化，及其诱导的TEMT；3.ALK5、TGF-βRⅡ的岩藻糖基化修饰可能是TGF-β1致肾间质纤维化的关键环节。

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文摘

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声明

综述 TGF-β1受体的岩藻糖基化水平与TGF-β的致纤维化作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

致谢