HepG2人肝癌细胞株细胞亚群克隆异质性与肝癌干细胞的实验研究

摘要

背景:越来越多的实验证明,肿瘤并非由均一的肿瘤细胞组成,肿瘤细胞具有异质性。即使在同一块肿瘤组织或者同一个细胞株内,不同肿瘤细胞在生长速度、增殖能力、分化程度、侵袭力、耐药特性等方面也存在差异,不同的细胞亚群克隆在细胞表型、分化程度上均有所不同。肿瘤异质性还表现在成瘤性的差异,根据在免疫缺陷小鼠体内致瘤能力的不同,可以将肿瘤细胞分为高致瘤能力的肿瘤干细胞(tumor stemcells,TSCs)和低致瘤能力或无致瘤能力的普通肿瘤细胞(non-tumorigenic cancer cells)。
　　 肿瘤干细胞虽然数量极少,但由于具有自我更新、无限增殖能力和多向分化潜能,是肿瘤发生、发展、复发、侵袭和转移的主要根源。目前研究已经证实,在血液系统恶性肿瘤和多种实体瘤中均存在肿瘤干细胞。正因为肿瘤干细胞与无致瘤能力的普通肿瘤细胞在分化程度、增殖能力等方面存在差异,在体外培养的条件下,克隆形成能力也显著不同,表现出不同细胞亚群克隆异质性。
　　 有研究报道,神经胶质瘤、皮肤癌、乳腺癌等细胞亚群克隆具有形态异质性,其中的一种克隆成瘤能力强,含有肿瘤干细胞。所以,细胞亚群克隆异质性尤其是形态上的异质性可能有助于对肿瘤干细胞进行检测和分选。有证据证明某些肝癌或肝癌细胞株也具有异质性,而且与肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)的存在可能相关。HepG2人肝癌细胞株是否存在克隆异质性?是否也可以用形态异质性的方法从HepG2细胞中分选出肝癌干细胞?目前尚未见报道。利用克隆形态异质性来识别和分选肿瘤干细胞的机制目前也不十分清楚,因此探讨肝癌细胞亚群克隆异质性与肝癌干细胞关系的研究具有重要的理论和实践意义。
　　 目的：1.研究HepG2人肝癌细胞株细胞亚群克隆的形态异质性及细胞周期的差别。
　　 2.研究HepG2人肝癌细胞株不同细胞亚群克隆的肝癌干细胞表面标记物CD133、ABCG2和CD90表达情况。
　　 方法:1.应用有限稀释法对体外培养的HepG2人肝癌细胞株进行单细胞克隆培养,倒置显微镜下观察不同克隆的形态。
　　 2.使用流式细胞仪检测细胞亚群克隆的细胞周期分布。
　　 3.使用免疫组织化学染色的方法检测细胞亚群克隆的肝癌干细胞标志物CD133、ABCG2和CD90的表达。
　　 4.用Western blotting法检测不同亚群克隆的ABCG2蛋白表达。
　　 结果:1.HepG2人肝癌细胞株存在形态不同的亚群克隆:克隆A细胞呈多角形或多形性,大小形态不一致,排列致密;克隆B细胞呈梭形,大小形态接近,排列松散。
　　 2.克隆A和克隆B细胞周期检测结果:克隆A:G0/G1期(72.13±3.25)％,S期(17.26±0.93)%,G2/M期(10.11±0.32)%;克隆B:G0/G1期(50.63±1.26)%,S期(25.07±1.24)%,G2/M期(24.31±0.14)%。克隆A的G0/G1期显著高于克隆B,差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3.免疫组织化学染色结果显示:克隆A的CD133、ABCG2和CD90的阳性表达率分别是66.67%(6/9)、71.12%(5/7)、80%(4/5);克隆B的CD133、ABCG2和CD90的阳性表达率分别是10%(1/10)、15.38%(2/13)、9.09%(1/11),差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4.Western blotting检测结果:克隆A在相对分子质量为70000 Da左右出现ABCG2蛋白阳性表达目的条带,与克隆B相比,克隆A的ABCG2蛋白表达显著增强,差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:1.HepG2人肝癌细胞株中存在异质性的细胞亚群克隆。
　　 2.HepG2人肝癌细胞株中不同的细胞亚群克隆可能富含肝癌干细胞。