茶多酚在大鼠的多组分药代动力学和抗自由基药效动力学及其相关性研究

摘要

目的：1）建立灵敏且高度特异的LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中茶多酚(Tea polyphenols，TP)的4种儿茶素类抗氧活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)和表儿茶素(EC)，从而研究TP在大鼠体内的多组分药代动力学。2）采用血清药理学方法，研究TP的抗自由基药效动力学。3）分析TP的多效应成分整合药代动力学与药效动力学(PK/PD)相关性。
　　 方法：血浆样品经乙酸乙酯液-液萃取；采用ESI离子源，多反应离子监测(MRM)，负离子扫描，测定EGCG、ECG、EGC和EC的血药浓度；用于定量分析的检测离子分别为m/z457.0→168.8(EGCG)，m/z441.0→168.8(ECG),m/z305.1→124.8(EGC),m/z289.1→108.8(EC),m/z150.9→135.8(内标，香草醛)。色谱柱为HypersilODSC18柱(2.1mm×150mm，5μm)，流动相为甲醇-水(30:70)，等度洗脱，流速：0.5mL·min-1:以香草醛为内标，采用峰面积内标法定量。大鼠单剂静脉注射(iv)和口服(po)TP及单组分EGCG不同时间收集血浆样品，测定血药浓度；ⅳ所得C-T曲线由3p97程序拟合房室模型，计算有关药动学参数：po给药后的C-T曲线按非房室模型方法求算有关药动学参数，评价po生物利用度。比较单组分给药及多组分给药时EGCG药动学的异同。制备胆瘘大鼠模型，以探讨po TP后C-T曲线双峰现象是否与肠肝循环(EHC)有关，并计算EHC分数。应用血清药理学方法研究TP的抗自由基作用及其动力学；以Fenton反应建立小鼠肝匀浆脂质过氧化体外模型，采用大鼠给药后不同时间采集的含药血清对体外小鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制率考察TP抗自由基效应，将效应(E)对时间(T)作图得E-T曲线，计算有关药效动力学参数。根据各成分在4种成分总AUC中所占比值自定义各成分在整合浓度中各自的权重系数，求算TP的整合浓度(Cint)，绘制Cint-T曲线，进一步进行多效应成分整合药动学的研究。以药效（脂质过氧化抑制率）对logCint作图，线性回归，以相关系数r表示E-logCint的相关性，同时以E与各儿茶素类成分的血药浓度对数(log Cj)作图，线性回归所得相关系数r进行比较。
　　 结果：EGCG、ECG、EGC、EC和IS的保留时间分别为1.70、3.53、1.18、2.29和2.86min，各物质之间达到基线分离。4种儿茶素类成分的标准曲线的线性范围分别为10～10000ng·mL-1(EGCG)和5～5000ng·mL-1（ECG、EGC和EC）(r＞0.9966)。QC样品的日内和日间精密度RSD均小于10％:准确度均在90%～110%;EGCG、ECG、EGC、EC及IS的血浆样品萃取回收率均大于72%，且基质效应在88%～106%。血浆样品室温保存至少8h内稳定，-20℃保存至少一个月内稳定，血浆样品经EtoAc萃取后2～4℃保存至少24h内稳定。静脉注射(iv)TP50mg·kg-1和100mg·kg-1后4种儿茶素类主要活性成分的血浆药代动力学均符合三室模型，EGCG、ECG、EC和EGC的消除半衰期t1/2γ分别为651～705min、605～621min、144～159min和101～104min，4种组分的Vd分别为24～28L·kg-1、16～17L·kg-1、4.2～7.8L·kg-1和7.1～7.3L·kg-1，CL分别为0.026～0.029L·min-1·kg-1、0.018～0.019L·min-1·kg-1、0027～0.038L·min-1·kg-1和0.041～0.046L·min-1·kg-1;口服TP50mg·kg-1和100mg·kg-1后上述4种组分按血管外给药非房室模型分析，其C-T曲线呈双峰或多峰现象，但胆瘘大鼠无此现象，提示TP口服C-T曲线的双峰或多峰现象与EHC有关，计算得EHC分数为6.1%～21.8%。由AUC估算，EGCG、ECG、EC和EGC平均生物利用度(F)分别为3.29～9.93%、3.27～8.85%、6.58～8.07%和9.24～14.3%。EGCG单组分iv给予TP50mg/kg，其t1/2为422min，Vd为25L·kg-1，CL为0.041min-1·kg-1，po生物利用度为1.34%。E-T曲线显示ivTP后抗自由基作用的衰减分为三个先快后慢的不同时相，其t1/2α，E、t1/2β，E、t1/2γ,E和AUE分别为9.86min、80.08min、688.43min和42103。整合药动学与药效动力学高度正相关，其E-logCint作图为一直线，线性回归后得相关系数r2为0.9978(iv50mg·kg-1)和0.9962(iv100mg·kg-1)，大于效应与单组分ECG、EGC和EC血药浓度对数作图（E-logCj图）所得相关系数，而与主要活性成分ECG所得相关系数一致。
　　 结论：本文建立的LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中TP主要活性成分EGCG、ECG、EGC和EC的浓度，经方法学验证表明特异性和灵敏度高、精密度好、回收率高，且基质效应可以忽略。药代动力学参数显示，TP在大鼠体内分布快速，自深室的消除较慢；分布广泛，远大于总体水；4种儿茶素成分口服吸收迅速，但生物利用度较低，均＜10%，4种儿茶素类化合物中酯型儿茶素类（EGCG和ECG）的动力学与非酯型儿茶素类（EGC和EC）的动力学存在明显差别，前者t1/2、Vd大于后者，但CL则小于后者。TP给药的多组分药动学与EGCG单组分给药的药动学进行比较，前者t1/2长，po生物利用度高，说明TP中EGCG在多组分给药时受到其他成分的影响，多组分给药与单组分给药有着不同的动力学行为。以血清药理学方法研究TP抗自由基药效动力学，将其效应指标（脂质过氧化抑制率）和时间代入3p97程序进行房室模型拟合，发现TP的药效动力学符合三室模型，其动力学参数显示，TP在本研究所用的剂量范围内药效学呈线性。ivTP50mg·kg-1和100mg·kg-1后的整合药代动力学符合三室模型，并且与药效动力学行为相吻合。多效应成分整合药代动力学较单一成分的药代动力学更能体现多组分、多靶点的中药整体药代动力学行为。