小鼠CD147胞外区结构域的表达纯化及糖基化初步分析

摘要

背景及目的：恶性肿瘤侵袭和转移的特性使其成为威胁人类生存的三大疾病之一。肿瘤的转移和侵袭是一个多步骤的复杂过程，是治疗恶性肿瘤的主要障碍和造成肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤转移的方式主要有淋巴道转移、血道转移和种植性转移。相关研究表明，肿瘤细胞表面的糖蛋白的糖基化形式和糖链结构与肿瘤转移密切相关。
　　 CD147又称EMMPRIN，属于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily，IGSF)的跨膜糖蛋白，在许多恶性肿瘤细胞的表面都有表达，是细胞膜的监视分子。CD147由2个胞外Ig结构域、1个跨膜结构域和1个胞内结构域组成。胞外区有3个Asn糖基化位点。由于N-糖基化不同，CD147可以同时表现为高糖型CD147(HG-CD147)和低糖型CD147(LG-CD147)。CD147主要通过诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的活性参与组织重构，细胞分化，血管生成，炎症及肿瘤转移。胞膜窖(Caveolae)是细胞表面胞膜内陷形成的结构。Cav-1是Caveolae膜结构的标记性蛋白，Cav-1在在恶性肿瘤发生、发展的多方面、多环节上发挥着关键的调控作用。
　　 本实验室已有研究表明：在小鼠肝癌细胞系中，CD147糖基化程度与肿瘤转移能力正相关。HG-CD147在高淋巴道转移潜能的小鼠肝癌细胞(Hca-F)中表达量较高，在低转移细胞株(Hca-P)中表达量较低，而LG-CD147在无转移潜能的小鼠肝癌细胞株(Hepa1-6)中占主要部分。另外，CD147糖基化与Cav-1呈正相关。Cav-1表达下调的Hca-F中HG-CD147表达减少，LG-CD147表达增加。Cav-1稳定表达的Hepa1-6中HG-CD147表达量上升，而LG-CD147蛋白表达量显著降低。
　　 本文旨在通过构建小鼠CD147胞外区分泌型质粒，在Hepa1-6及Hepa1-6/Cav-1细胞中表达并纯化CD147胞外区蛋白。通过对比有无Cav-1存在两种条件下CD147胞外区蛋白的糖型和糖链结构，推测CD147糖基化与肿瘤转移的关系及Cav-1对CD147糖基化调节的分子机制。
　　 实验方法：1．重组表达载体pCDNA3.1/CD147的构建
　　 PCR获取小鼠肝癌细胞Hepa1-6中CD147胞外区结构域的基因。将分泌型信号肽及CD147胞外区嵌合基因插入到表达载体pCDNA3.1中，构建分泌型真核表达载体pCDNA3.1/CD147。
　　 2．pCDNA3.1/CD147在Hepa1-6及Hepa1-6/Cav-1中的表达纯化
　　 利用脂质体将重组表达载体pCDNA3.1/CD147瞬时转染至Hepa1-6及Hepa1-6/Cav-1细胞中。ELISA检测细胞培养上清中24h，48h，72h融合蛋白的表达。在此基础之上进行大量转染，利用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白，利用SDS-PAGE，Western-blot鉴定目的蛋白的表达。
　　 3．CD147-His融合蛋白的生物活性检测及糖基化初步分析
　　 利用纯化所得融合蛋白刺激小鼠成纤维细胞，明胶酶谱法检测其分泌MMP2/MMP9的变化量。利用ELISA，凝集素印迹，质谱等方法对融合蛋白糖基化进行分析。
　　 结果：1．利用PCR扩增出大小约560bp的小鼠CD147胞外区目的基因，并成功引入分泌型信号肽，构建完成分泌型真核表达载体pCDNA3.1/CD147。
　　 2．利用脂质体瞬时转染Hepa1-6及Hepa1-6/Cav-1细胞后，ELISA结果显示24h时间段培养上清中蛋白含量最高。大量转染后，利用表达载体上的His-tag亲和层析纯化得到目的蛋白。SDS-PAGE及Western-blot结果显示目的蛋白分子量约48kD。
　　 3．明胶酶谱结果显示目的蛋白具有生物学活性，能够诱导成纤维细胞产生MMP9;ELISA及Dot blot结果显示目的蛋白能够与凝集素PHA-E特异性结合。
　　 结论：1．成功构建了分泌型重组表达载体pCDNA3.1/CD147。
　　 2．实现了重组表达载体pCDNA3.1/CD147在Hepa1-6及Hepa1-6/Cav-1细胞中的表达及纯化。
　　 3．在Hepa1-6细胞中所纯化的CD147-His融合蛋白具有生物学活性，且该蛋白糖链含有平分型GlcNAc分支结构。