小鼠诱导多潜能干细胞的体外培养和兔角膜内皮细胞的体外分离培养及共培养研究

摘要

目的:体外培养小鼠诱导多潜能干细胞以及体外分离、培养兔角膜内皮细胞，了解这两种细胞的体外增殖生长特性，并通过共培养方式诱导诱导多潜能干细胞向角膜内皮样细胞分化，并观察小鼠诱导多潜能干细胞与兔角膜内皮细胞共培养前后的形态学变化，检测其功能性蛋白质-水通道蛋白1(Aquaporinl，AQPl)的表达，为研究诱导多潜能干细胞向角膜内皮细胞的分化提供实验依据，以探讨诱导后的诱导多潜能干细胞作为替代角膜内皮细胞进行移植手术的种子细胞的可行性。
　　 方法:
　　 1、利用饲养层细胞法对小鼠诱导多潜能干细胞进行体外培养扩增以及传代，观察细胞的生长状态。取P2细胞，并用Western blotting对细胞进行鉴定。
　　 2、揭膜法获取新西兰大白兔眼后弹力层及内皮细胞层，置于细胞培养皿中进行培养，观察及描绘角膜内皮细胞的生长状态。取P1细胞，利用免疫组织化学鉴定角膜内皮细胞的相对特异性蛋白质-神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase，NSE)。
　　 3、将小鼠诱导多潜能干细胞与兔角膜内皮细胞分别接种于Transwell上、下两室，经共培养2周后，观察诱导后的小鼠诱导多潜能干细胞的形态，免疫组织化学检测AQP1的表达。
　　 结果:
　　 1、复苏后的小鼠诱导多潜能干细胞进行体外培养扩增，复苏2-3d后可见微小克隆出现，之后细胞体积增大，呈典型的克隆样生长，克隆呈圆形或椭圆形，边界清晰，折光性好，高倍镜下形似鸟巢。克隆内细胞排列紧密，细胞体积较小，细胞核大，核仁清晰，细胞核/质比例高;4-6d后铺满瓶底约80％左右可以进行传代，传代细胞增殖明显快于原代细胞;3-4d细胞增长最为活跃。取P2细胞，Western blotting检测Sox2、Oct4以及Nanog三种转录因子标志蛋白均呈阳性。
　　 2、揭摸法分离培养的原代兔角膜内皮细胞，48h后大部分细胞已贴壁，未被吹散的成团细胞贴壁后开始向周边移行增殖，5d后形成良好的单层，呈“铺路石”状，6-7d后细胞分裂旺盛，细胞形态变为长而扁平的梭形，呈现典型的成纤维细胞形态，10d后呈“漩涡”状排列，中央细胞呈短梭形或三角形，周边细胞失去固有形态，呈不规则性。2周后细胞达到80％融合，细胞呈六边形，紧密排列便可以进行传代。传代24h后，角膜内皮细胞大部分已经贴壁;细胞生长曲线基本呈“S”形，第2-5d生长活跃，为对数生长期，1周达生长密集状态，形态呈椭圆形，并向多边形变化;免疫组织化学检测细胞NSE表达，胞浆见棕黄色粗大颗粒，染色呈阳性。
　　 3、小鼠诱导多潜能干细胞与兔角膜内皮细胞在Transwell共培养系统中培养2周后，细胞形态无明显改变，但免疫组织化学检测诱导后的小鼠诱导多潜能干细胞的AQP1表达，胞膜染色呈阳性。
　　 结论:通过上述方法可以成功获得纯度较高且活性较好的小鼠诱导多潜能干细胞以及兔角膜内皮细胞;利用Transwell共培养系统可以成功诱导小鼠诱导多潜能干细胞表达角膜内皮功能性蛋白质AQP1，诱导多潜能干细胞具有向角膜内皮细胞分化的潜能;诱导后的诱导多潜能干细胞将来很有可能作为替代角膜内皮细胞进行移植治疗角膜内皮病变和损伤的种子细胞。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1．材料

2．方法

结果

1．小鼠iPSCs的培养及鉴定结果

2．RCECs的培养及鉴定结果

3．免疫组织化学染色鉴定AQP1的表达

讨论

结论

参考文献

综述

致谢