孢子丝菌病的流行病学、致病菌的分类鉴定、表型特征及对中西药物的敏感性研究

摘要

第一部分大连地区205例孢子丝菌病的流行病学调查
　　 目的:对大连地区的205例孢子丝菌病进行总结，分析其流行病学特征。
　　 方法:回顾性分析1998年至2011年就诊于大连医科大学附属第一医院，并确诊为孢子丝菌病患者的临床资料。
　　 结果:大连医科大学附属第一医院近14年来孢子丝菌病的患者人数每年大约15例，未见大幅增长，发病趋势平稳。女性发病率略高，男女发病比率为1∶1.14。发病年龄最小为3岁，最大为83岁，40～69岁的中老年人为主体(74.7％)，儿童也占一定比例(10.7％)。冬春季节是孢子丝菌病的高发季节。多数有外伤史(62.4％)。临床分型以固定型最常见占51.2％，其次是淋巴管型占37.6％，有1例皮肤播散型不伴有免疫缺陷和基础疾病。发病部位以上肢为主(47.8％)，其次是面部(37.1％)。固定型多发生在面部和上肢，淋巴管型多发生在上肢，播散型表现为全身感染。面部皮损中固定型的比例(69.7％)高于四肢皮损中固定型的比例(44.1％)，由此可见面部相对于四肢更易发生固定型皮损。患者主要来自大连周边地区的农村，以庄河、普兰店、瓦房店为高发地区。
　　 结论:相对于吉林地区近几年的小范围流行，大连地区孢子丝菌病发病趋势平稳，属于散发病例。流行病学特征与国内其他报道相似。报道1例无免疫异常的皮肤播散型孢子丝菌病。
　　 第二部分我国东北地区孢子丝菌的分类鉴定与种系发生特征的研究
　　 目的:对我国东北地区孢子丝菌病的临床分离株进行分子鉴定和种系发生分析，了解孢子丝菌复合体在我国占优势的种类;不同的临床类型的分离株属于同种还是异种;吉林地区的流行病例和黑龙江、大连的散发病例的临床分离株属于同种还是异种。
　　 方法:通过大体菌落特点、显微镜下分生孢子特点和温度双相性进行形态学初步鉴定;以钙调蛋白基因序列为位点，通过测序的方法对74株临床分离株进行分子鉴定;在此基础，再用Neighbor-Joining分析法将上述74株和16株文献报道的各个种共同建立孢子丝菌种系发生树。
　　 结果:所有分离株经大体菌落特点、显微镜下呈花瓣样的分生孢子、温度双相性转变，形态学鉴定为传统意义上的申克氏孢子丝菌。然后对部分钙调蛋白(CAL)基因片段进行测序并在Genbank数据库上比对，与文献中已经报道的球形孢子丝菌的模式株AM116908具有99％的相似性，与球形孢子丝菌的模式株AM490354具有100％的相似性，而与申克氏孢子丝菌的模式株AM117437的相似性仅为88％。用Neighbor-Joining分析法基于位点CAL序列对74株临床分离株和16株文献报道的各个种建立孢子丝菌种系发生树，结果显示6个明确的组，即6个孢子丝菌的种。本研究中来自于中国东北地区的所有临床分离株均与已报道的球形孢子丝菌（AM116908.1和AM399018）聚为一类。而且，球形孢子丝菌又被进一步分成2个亚组:68株临床分离株与AM116908.1聚为一个亚组，而且与文献报道的我国环境分离株在同一个亚组。剩下的6株分离株与AM399018聚为另一个亚组。
　　 结论:
　　 (1)本研究第一次对中国的孢子丝菌临床株进行种系发生分析，球形孢子丝菌是目前中国东北地区主要的致病菌种。
　　 (2)孢子丝菌病临床形式与孢子丝菌的种系发生的种无明确相关性。
　　 (3)吉林省小范围流行由球形孢子丝菌引起。
　　 (4)在种系发生上，球形孢子丝菌可进一步分成2个亚组。
　　 第三部分我国球形孢子丝菌的表型特征、体外对中西药物的敏感性研究
　　 目的:对我国的球形孢子丝菌进行表型特征分析，以便日后在真菌化验室可常规开展相关的检查，迅速鉴定到种。同时了解球形孢子丝菌体外对抗真菌药物的敏感性，并探索具有抗孢子丝菌活性的中药单体，为临床提供新的辅助治疗措施。
　　 方法:
　　 (1)将菌株接种在不同的平皿培养基中[燕麦培养基(OA)、玉米粉琼脂培养基(CMA)、马铃薯琼脂培养基(PDA)、沙氏琼脂培养基(SDA)]，接种后将培养皿放在30℃温箱暗处培养21天，比较菌落在不同培养基上形态变化及生长速度。
　　 (2)玻片小培养(CMA)30℃培养10天，光镜下观察分生孢子特点。
　　 (3)温度试验:将菌株接种于PDA培养皿，分别置于30℃、35℃、37℃温箱中暗处培养21天，观察菌落直径。
　　 (4)对葡萄糖，蔗糖和棉子糖进行碳源同化试验，试验在96孔板进行。
　　 (5)检测74株孢子丝菌对特比萘芬、伊曲康唑、两性霉素B、卡泊芬净的体外敏感性，药敏试验采用微量液基稀释法，参照美国临床和实验室标准研究所(CLSI)颁布的M38-A2方案，选用孢子丝菌的菌丝相进行操作。
　　 (6)应用上述方法探索3种中药单体（丁香酚、柠檬醛、肉桂醛）对孢子丝菌的抗真菌活性。
　　 结果:
　　 (1)所有的菌株在4种培养基中的宏观形态都是相似的，菌落表面均有皱褶，边缘有短绒毛。菌落表面产出的黑色素:燕麦培养基＞玉米培养基＞土豆培养基＞沙氏培养基。
　　 (2)CMA培养基30℃培养10天后，显微镜下不仅见到呈花瓣状分布的半透明的卵圆形的分生孢子，还可见到厚壁的深棕色分生孢子，呈球形或近球形，典型呈套袖状分布。
　　 (3)所有菌株的最佳生长温度是30℃。在PDA上30℃暗处孵育21天后，菌落直径达25～45mm，平均直径是34mm。在PDA上35℃暗处孵育21天后，菌落直径达12～15mm，平均直径是13mm。在PDA上37℃暗处孵育21天后，大多数菌株显示限制性生长，直径平均9mm，有3株例外，不能在37℃生长。
　　 (4)碳源同化试验:所有的菌株都能同化葡萄糖和蔗糖，不能同化棉子糖。
　　 (5)对孢子丝菌的菌丝相，特比萘芬表现出最好的体外抗真菌活性，MIC值为0.06～0.5μg/ml，GM值为0.1866μg/ml;其次是两性霉素B，MIC值为2～8μg/ml，GM值为4.8252μg/ml;伊曲康唑和卡泊芬净的MIC值均较高。每种抗真菌药对不同临床类型的球形孢子丝菌的MIC值之间无统计学差异。
　　 (6)中药单体（丁香酚、柠檬醛、肉桂醛）对30株球形孢子丝菌的MIC值的几何均值分别是709.1481μg/ml，509.0566μg/ml，437.8494μg/ml，统计学分析显示，柠檬醛和肉桂醛的抗孢子丝菌活性明显强于丁香酚。
　　 结论:
　　 (1)球形孢子丝菌能产生球形或近球形的着色分生孢子，在PDA上30℃孵育21天菌落直径小于50mm。
　　 (2)球形孢子丝菌能同化蔗糖，不能同化棉子糖。
　　 (3)球形孢子丝菌在37℃有的不能生长，有的呈限制性生长。
　　 (4)四种抗真菌药中，特比萘芬显示最好的体外抗真菌活性，具有最低的MIC几何均值。球形孢子丝菌对药物的敏感性与致病的临床形式无关。
　　 (5)柠檬醛和肉桂醛的抗孢子丝菌活性明显强于丁香酚。

目录

声明

摘要

第一部分 大连地区205例孢子丝菌病的流行病学调查

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 我国东北地区孢子丝菌的分类鉴定与种系发生特征的研究

前言

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1．形态学鉴定

2．分子生物学鉴定

讨论

结论

参考文献

第三部分 我国球形孢子丝菌的表型特征、体外对中西药物的敏感性研究

前言

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1．菌落大体形态

2．显微境下分生孢子特点

3．温度试验

4．碳源同化试验

5．74株球形孢子丝菌对4种抗真菌药的体外敏感性

6．3种中药单体对30株球形孢子丝菌的抗真菌活性

讨论

结论

参考文献

综述

附录

攻读学位期间发表论文情况

致谢