肿瘤相关巨噬细胞在非小细胞肺癌上皮间质转化中的作用和机制研究

摘要

目的:
　　肿瘤微环境是由多种间质细胞、活性介质与肿瘤细胞共同构成，是肿瘤发生、发展和转移过程中的关键环节。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associatedmacrophages，TAMs)是浸润在肿瘤间质里的巨噬细胞，为肿瘤微环境中数量最多的炎症细胞群。TAMs根据其微环境的不同分为经典活化型(M1)和替代活化型(M2)。大量研究显示TAMs多呈M2表型，可促进肿瘤生长和转移，并诱导免疫抑制。已有研究发现肿瘤侵袭过程中M2表型的TAMs数量增多与包括肺癌在内的多种实体瘤的进展和不良预后有关。然而，TAMs影响NSCLC进展的确切机制仍不清楚。
　　糖基化是一种真核基因表达过程中常见的翻译后调控事件。异常糖基化是肿瘤的标志性特征，与多种酶尤其是糖基转移酶的异常表达有关。Lewis(LewisantigenY，LeY)是结合在糖蛋白和糖脂末端的寡糖，60-90％上皮来源的肿瘤都有此蛋白的表达，属于A、B、H血型抗原家族。FUT4作为1，3-FUT，是Lewis寡糖中LeY合成的关键酶。研究证实可通过调控岩藻糖基转移酶来间接调控细胞表面寡糖抗原的表达。近期研究表明FUT4/LeY在多种实体瘤中高表达，并与侵袭、转移及不良预后有关。然而，针对肺癌微环境中M2型巨噬细胞与FUT4/LeY的相互作用的研究仍甚少，肿瘤微环境中的免疫细胞及其分泌因子与肿瘤岩藻糖基化的关系尚未见报道。
　　EMT指上皮-间质转变，是上皮细胞转变成间充质细胞后，拥有移行能力，是肿瘤细胞具备高侵袭和高转移能力的重要环节。在此进程中，上皮细胞失去原有的极性，细胞间粘附性降低，细胞骨架重构改变，具备间充质细胞的迁移和可塑性特征，可表现为上皮标记物E-cadherin表达降低，间质标记物N-cadherin及EMT相关转录因子Snail等表达水平升高。大量研究表明EMT在多种恶性肿瘤细胞的生长和肿瘤侵袭转移中发挥着重要作用。
　　本研究采用免疫组化SP法标记CD68进行TAMs计数，按其均值分为高、低表达组。对59例NSCLC患者癌组织及癌旁肺组织中TAMs计数与NSCLC患者性别、年龄、吸烟史、病理类型、分化程度、T分期、临床分期及淋巴结阳性的关系及其对预后的影响进行分析。并进一步通过western blot、免疫荧光、transwell等体外实验方法和裸鼠成瘤实验验证TAMs与EMT的关系及FUT4/LeY在该过程中的作用。
　　方法:
　　1、用回顾性方法收集2005年8月至2009年8月大连医科大学附属第一医院手术切除并在病理科存档的59例NSCLC患者的组织蜡块，分别取癌及癌旁正常组织。采用免疫组化SP法检测患者肿瘤间质、癌巢及癌旁组织中CD68+巨噬细胞数，结合随访资料分析TAMs计数的高低与临床病理特征预后的相关性，以及对无病生存期（Diease-free survival，DFS）、总生存期(Overall survival，OS)等预后指标的影响。所有病例均经组织病理学或细胞学明确诊断。临床总分期及T分期依据国际间肺癌研究组织制订的分期标准(AJCC/UICC)。
　　2、采用western blot检测E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Snai等EMT标志蛋白以及FUT4/LEY的表达。
　　3、采用间接免疫荧光方法检测E-cadherin、β-catenin的表达。
　　4、利用transwell及划痕实验实验观察和分析细胞侵袭和迁移能力。
　　5、采用大连医科大学实验动物中心提供的BALB/c-nu SPF级雄性裸鼠（6-8周龄），体重16～18g，进行体内皮下成瘤实验。
　　6.采用SPSS17.0软件进行统计分析。计数资料以率(％)表示，计量资料组间比较采用了单因素方差分析;DFS与OS采用Kaplan-Meier方法进行生存分析，生存率通过Log-Rank方法进行比较;多因素相关性分析采用COX回归分析。假设α=0.05为检验水准，P＜0.05或P≤0.01有差异提示有统计学意义。
　　结果:
　　1、NSCLC肿瘤间质胞质中TAMs计数显著高于癌巢及癌旁正常组织，阳性率及细胞计数分别为94％(53.65±14.52)、88％(9.92±3.12)、85％(6.83±2.26)，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
　　2、TAMs计数与NSCLC淋巴结转移、TNM分期有关，其阳性率及计数分别为65.3％(74.36±14.78)、90.4％(59.83±16.21)，显著高于淋巴结转移阴性、Ⅰ-Ⅱ期10％(41.2±10.23)、52.6％(41.69±15.6)(P＜0.05)。TAMs计数与与性别、年龄、吸烟史、病理类型、分化程度、T分期无相关性(P＞0.05)。
　　3、Kaplan-Meier单因素生存分析显示，TAMs计数与NSCLC的DFS和OS相关(P＜0.01)。TAMs高计数组中位DFS（月）为26.512，明显低于TAMs低计数组42.938。这表明TAMs计数可作为NSCLC的术后复发预测因子;TAMs高计数组中位OS（月）为65.563，明显低于TAMs低计数组91.105;单因素生存分析显示，吸烟史、TNM分期、淋巴结转移阳性均与NSCLC的OS相关(P＜0.05或P＜0.01)。性别、年龄、病理类型、分化程度、T分期与OS无关(P＞0.05)。这表明TAMs可作为NSCLC的预后因子;多因素COX回归分析显示，TAMs计数、淋巴结阳性、TNM分期均为NSCLC的独立预后危险因素。
　　4、本研究先用PMA及IL-4、IL-13导出M2型巨噬细胞，然后通过将M2型巨噬细胞的条件培养基与肺腺癌细胞系A549及H1299共培养后，观察到白光下肺癌细胞由原本上皮细胞特有的排列规则、结构紧密、细胞多边，变为了排列杂乱、结构疏散、细胞梭形，然后通过western blot、免疫荧光、transwell及细胞划痕实验的结果也提示M2巨噬细胞可以通过TGF-β引起肿瘤细胞发生EMT、侵袭和迁移。
　　5、Western blot检测发现，M2巨噬细胞条件培养基组及外源性TGF-β浓度梯度组FUT4/LEY蛋白的表达较对照组明显增加(P＜0.05);进一步应用TGF-β拮抗剂SB431542后，FUT4/LEY蛋白表达明显降低(P＜0.05);在外源性TGF-β相同的条件下，western blot显示si-FUT4组较对照组相比，钙调蛋白N-cadherin、Vimentin核蛋白表达明显降低(P＜0.05)，上述结果均提示TGF-β介导的FUT4/LeY与EMT发生密切相关。
　　6、裸鼠皮下成瘤实验发现，混合注射组（M2巨噬细胞+A549）肿瘤大小及体积均明显高于单纯注射组(A549);瘤体免疫组化检测发现混合注射组EMT相关蛋白E-cadherina降低，Vimentin升高(P＜0.05)，提示TAM通过分泌TGF-β促进NSCLC中FUT4/LeY表达，从而介导EMT、肿瘤生长和侵袭转移。
　　结论:
　　1、TAMs计数的高低与NSCLC患者的TNM分期及淋巴结转移相关，参与了NSCLC的发生发展过程。
　　2、TAMs计数与NSCLC的DFS相关，TAMs计数可作为NSCLC的术后相关复发预测因子。
　　3、TAMs计数与NSCLC的OS相关，TAMs计数、TNM分期、淋巴结阳性是NSCLC的独立预后因子。
　　4、FUT4/LeY作为TAMs引起EMT发生的关键环节，影响着肿瘤生长和侵袭转移，在未来有望成为肿瘤免疫治疗的新靶点。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

一、临床资料

二、实验材料

二、实验方法

结果

一、TAMs在NSCLC组织中的定位和表达

二、TAMs计数与NSCLC临床病理特征的关系

三、癌组织中TAM计数与NSCLC预后的关系

四、TAMs在NSCLC细胞系EMT中的作用及机制研究

五、FUT4／LeY在M2巨噬细胞介导的EMT中发挥关键作用

六、动物模型验证TAMs能够促进NSCLC的生长及EMT

讨论

结论

参考文献

综述 非小细胞肺癌的免疫治疗策略及研究进展

致谢