The Effect of Niclosamide on Expression of DC-SIGN in Gastric Cancer Cells

摘要

背景：
　　胃癌患者初期症状不典型，被确诊时常常处于晚期阶段。细胞分化和增殖相关的基因表达程序紊乱可导致胃癌的发生。这些不平衡可能是由于微小RNA（miRNA）或树突状细胞特异性细胞间粘附分子3结合非整合素（DC-SIGN）的调节异常引起。DC-SIGN又称分化分子209（CD209）。C型凝集素DC-SIGN是一种与病原体和肿瘤逃逸相关的模式识别受体。DC-SIGN可捕获病原体表面的抗原片段，然后在树突状细胞的表面形成簇。这使得病原体能够定植于树突状细胞，逃离机体的免疫监视过程。炎症时，DC-SIGN通过病原体相关分子模式（PAMP）识别病原体。这一识别过程促进与Th1或Th2反应性至关重要的成熟促炎细胞因子的生成。因此，作者等猜测抗癌药物氯硝柳胺可能通过调控DC-SIGN的表达介导肿瘤的免疫治疗。在肿瘤的免疫治疗过程中，可研发针对抵抗DC-SIGN片段的疫苗，促进对肿瘤更特异的T细胞的形成。
　　微小RNA（microRNA）是一组基本上不编码的小RNA分子。MicroRNA长度约19-24个核苷酸。它们作用于mRNA的3’UTR区域。MicroRNA参与靶基因mRNA的表达与调控。MicroRNA可降解mRNA或干扰其翻译。它们基本上确定了基因的最终产物。近年来，研究表明microRNA可通过作用于一些树突状细胞表面的病原体模式识别受体如DC-SIGN，参与肿瘤的发生和免疫调控。MicroRNA对树突状细胞的干扰导致其抗原的分泌。同时，MicoRNA也可能与树突状细胞的成熟相关。树突状细胞参与炎症过程中细胞因子的释放，调节B细胞和T细胞的表达。它是免疫系统的调节剂。而T细胞的调控转录又与microRNA密切相关。因此，microRNA的失调可能导致TH细胞亚群的缺陷，导致疾病发生。
　　肿瘤细胞可以引起树突状细胞中miRNA表达水平的改变，导致肿瘤的发生。miRNA是先天性免疫系统和获得性免疫系统的桥梁。研究与树突状细胞功能相关的miRNA可能对研究肿瘤有一定的意义。因此，可以寻找一种与DC-SIGN和miRNA靶向作用的药物治疗肿瘤。
　　氯硝柳胺，一种抗蠕虫药物，近年来报道与很多肿瘤相关。但是，氯硝柳胺与胃癌中DC-SIGN和miRNA-4316表达的关系尚未报道。研究表明氯硝柳胺可影响与肿瘤有关的信号通路。氯硝柳胺是由食品和药物管理局（FDA）批准的抗蠕虫药。它已被用于治疗寄生虫感染50多年。氯硝柳胺又称纳曲酮。研究报道氯硝柳胺参与Wnt/β-catenin信号通路，信号转导子和转录激活因子3（STAT3），活化B细胞的核因子κ-轻链增强子（NF-Jb），哺乳动物靶向的雷帕霉素复合物或雷帕霉素复合物1（mTORC1）和Notch信号通路等。氯硝柳胺还可干扰肿瘤细胞中的线粒体，引起细胞周期的停滞。而notch信号通路，STAT3和Wnt/β-catenin信号通路与胃癌的发生密切相关。因此，氯硝柳胺在胃癌治疗中的作用有待研究。
　　目的：
　　氯硝柳胺对胃癌细胞BGC-823和SGC-7901中DC-SIGN表达量的影响及其机制的初步研究。
　　方法：
　　体外评价氯硝柳胺对胃癌细胞株的影响。采用不同浓度的氯硝柳胺，作用于胃癌细胞株24小时后检测其DC-SIGN的表达情况。提取胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823的RNA和蛋白质。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）检测药物作用后胃癌细胞株中DC-SIGN的RNA表达情况。采用免疫印迹技术（Western blot）检测药物作用后胃癌细胞株中DC-SIGN的蛋白质表达情况。采用划痕实验检测药物对胃癌细胞迁移能力的影响。作者等采用qRT-PCR技术研究了miRNA-4316,miRNA-4722-5p，miR-6849-3p和miR-3929在氯硝柳胺作用胃癌细胞前后的表达情况。采用灰度分析软件进行凝胶分析，比较组间的差异。实验数据采用GraphPad Prism5.00软件进行单因素方差分析。
　　结果：
　　（1）氯硝柳胺影响胃癌细胞株中DC-SIGN mRNA的表达。作者等检测胃癌细胞经氯硝柳胺作用后其DC-SIGN的表达情况。结果表明，在BGC-823细胞株中，1μM氯硝柳胺可上调DC-SIGN的表达。在SGC-7901细胞株中，0.5μM氯硝柳胺上调DC-SIGN的表达,而在2μM和4μM浓度作用下表达降低采用定量PCR技术进一步证实了上述RT-PCR的结果。（2）氯硝柳胺影响胃癌细胞株BGC-823中DC-SIGN的蛋白表达。采用不同浓度的氯硝柳胺孵育BGC-823细胞24小时。结果表明，在BGC-823细胞株中，1μM氯硝柳胺显著上调DC-SIGN的蛋白表达，而在2μM和4μM浓度下表达下调。（3）氯硝柳胺抑制胃癌细胞株BGC-823的迁移能力。（4）应用生物信息学技术预测与DC-SIGN相关的miRNA。为了进一步研究氯硝柳胺对胃癌细胞株中miRNA的表达影响，使用相关数据库分析结合DC-SIGN的3'UTR的miRNA。数据库分别是Diana，Miranda，miRDB，Target Scan和miRNA-Target交互数据库（mirTarBase）。上述四个数据库中共筛选到了4种与DC-SIGN相关的miRNA，即hsa-miR-4316，hsa-miR-4722-5p，hsa-miR-6849-3p和hsa-miR-3929。（5）氯硝柳胺对胃癌细胞中miRNA-4316，miRNA-4722-5p，miR-6849-3p和miR-3929表达的影响。通过氯硝柳胺对BGC-823和SGC-7901细胞的作用发现：在BGC-823细胞中，1μM氯硝柳胺药物作用下miRNA-4316表达量显著增加,而在2μM和4μM浓度作用下表达下调。在SGC7901细胞株中，0.5μM氯硝柳胺上调miR-4316的表达，而在1μM，2μM和4μM下miR-4316表达降低。在BGC-823细胞中，0.5μM和1μM氯硝柳胺药物作用下miR-4722-5p的表达量增加，而在2μM和4μM下miR-4316表达降低。miR-6849-3p在0.5μM和1μM氯硝柳胺药物作用下其表达量也增加，而在2μM和4μM下miR-4316表达降低。而miR-3929在药物作用后其在胃癌细胞株中的表达量并无显著性差异。
　　结论：
　　氯硝柳胺上调胃癌细胞株BGC-823和SGC-7901中DC-SIGN的表达。氯硝柳胺抑制胃癌细胞株BGC-823的迁移能力。基因数据库（Diana，MiRDB，TargetScan和mirTarBase）预测共有4种miRNA与DC-SIGN相关，即hsa-miR-4316，hsa-miR-4722-5p，hsa-miR-6849-3p和hsa-miR-3929。氯硝柳胺影响胃癌细胞株中hsa-miR-4316，hsa-miR-4722-5p和hsa-miR-6849-3p的表达。推测：氯硝柳胺通过对DC-SIGN与hsa-miR-4316，hsa-miR-4722-5p和hsa-miR-6849-3p表达的影响参与了胃癌细胞株的发生和发展。

目录

声明

Introduction

Justification of the Study

Material and methods

1. Cell lines and cell culture

2. Niclosamide drug

3. Quantitative Reverse Transcription–Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).

4. Wound Healing Assay

5. Protein Extraction and western blotting

5. Statistical analysis

Results

1. Expression of DC-SIGN in BGC-823 and SGC-7901 gastric cancer cells.

2. Niclosamide influenced the DC-SIGN mRNA expression on gastric cancer.

3. Niclosamide affects DC-SIGN protein expression in gastric cancer cell line BGC-823

4. Niclosamide inhibited gastric cancer cell BGC-823 and SGC-7901.

5. Application of bioinformatics techniques to predict miRNA associated with DC-SIGN.

6. Niclosamide affected on miRNA-4316, miRNA-4722-5p and miRNA -6849-3p expression in gastric cancer cells

Discussion

Conclusion

参考文献

Appendix

LITERATURE REVIEW: The Occurrence and Development of Gastric Cancer

致谢