7-O-香叶基槲皮素与MicroRNA协同逆转ABC转运蛋白介导的乳腺癌耐药作用的研究

摘要

目的:考察7-O-香叶基槲皮素(7-O-geranylquercetin，GQ)与MicroRNA协同逆转ABC转运蛋白介导的乳腺癌耐药作用并探究其作用机制。
　　方法:(1)在体外研究miRNA对乳腺癌耐药细胞MCF-7/adr的耐药逆转作用及机制中，采用CCK-8法检测阿霉素(ADR)对MCF-7/adr及MCF-7细胞增殖的影响，测定转染miRNA后MCF-7/adr及MCF-7对阿霉素的敏感性，计算耐药倍数和逆转倍数;采用Real-Time PCR(RT-PCR)检测MCF-7/adr及MCF-7细胞中miRNA的表达;分别采用RT-PCR和Western Blot检测转染miRNA之后MCF-7/adr细胞中基因MRP1、BCRP和MDR1的表达及蛋白MRP1、BCRP和P-gp的表达。(2)在体外研究miRNA联合GQ对MCF-7/adr的耐药逆转作用及机制中，采用CCK-8法检测转染miRNA以及加入GQ后MCF-7/adr对阿霉素的敏感性，计算其逆转耐药倍数;分别采用RT-PCR及Western Blot检测转染miRNA以及加入GQ之后MCF-7/adr中基因MRP1、BCRP、MDR1的表达及蛋白MRP1、BCRP、P-gp的表达;流式细胞仪检测miRNA与GQ对MCF-7/adr细胞周期的影响;采用程序AutoDock4.2将蛋白MRP1(PDB∶5UJA)/P-gp(PDB∶4XWK)和配体GQ进行分子对接。(3)在体内研究miRNA与GQ联合应用对MCF-7/adr的耐药逆转作用及机制中，皮下接种MCF-7/adr细胞，建立裸鼠移植瘤模型;将脂质体CDO14与miR451形成复合物，复合物及阿霉素尾静脉注射给药，GQ灌胃给药;测量瘤体积和小鼠体重;Western Blot及Immunohistochemistry检测肿瘤组织中P-gp的表达情况。
　　结果:(1)在体外研究miRNA对MCF-7/adr的耐药逆转作用及机制中，CCK-8结果显示MCF-7/adr对ADR的耐药倍数是MCF-7的10倍;RT-PCR结果显示在MCF-7/adr中miR-451、miR-326、miR-328低表达，miR-155高表达;CCK-8结果显示miR-451minics、miR-326minics、miR-328minics和miR-155inhibitor能够逆转耐药，且miR-451minics的逆转作用最强;RT-PCR和Western Blot结果表明，miR-451minics和miR-155inhibitor能够抑制基因MDR1及蛋白P-gp的表达，miR-326minics、miR-328minics分别抑制基因MRP1、BCRP及蛋白MRP1、BCRP的表达;miRNA通过调控基因来抑制耐药蛋白的表达，从而逆转乳腺癌的耐药。(2)在体外研究miRNA与GQ联合应用对MCF-7/adr的耐药逆转作用及机制中，CCK-8结果表明当GQ与miR-451minics或miR-155inhibitor联合应用时耐药逆转倍数显著提高;RT-P CR以及Western Blot结果表明GQ与miR-451minics或miR-155inhibitor联合应用可通过调控基因MDR1进而抑制其下游蛋白P-gp的表达来逆转耐药;细胞周期检测表明，GQ及miR-451与阿霉素联合应用跟单用阿霉素相比细胞周期未发生明显改变，说明二者通过抑制阿霉素的外排而逆转耐药，增强阿霉素抗肿瘤的作用;AutoDock结果显示GQ能够与耐药蛋白MRP1、P-gp结合从而抑制其外排作用。(3)在体内研究miR-451与GQ联合应用对MCF-7/adr的耐药逆转作用及机制中，从抑瘤效果来看，GQ和miR-451分别与阿霉素联合应用能增强其抑瘤作用，GQ、miR-451与阿霉素共用时抑瘤作用更强;Western Blot与Immunohistochemistry结果显示，单独使用阿霉素不影响P-gp的表达，单独使用GQ或miR-451以及二者分别与阿霉素联合应用能够抑制P-gp的表达，GQ与miR-451联合应用时肿瘤组织中P-gp的表达量更低，说明两者联合应用能增强对耐药蛋白P-gp的抑制作用。
　　结论:miR-451minics、miR-326minics、miR-328minics及miR-155inhibitor通过调控ABC药物外排转运蛋白的基因及蛋白的表达而逆转乳腺癌MCF-7/adr对阿霉素耐药，且miR-451逆转作用最强;miR-451通过调控MDR1基因而抑制P-gp蛋白的表达，减少阿霉素的外排;GQ通过与P-gp蛋白结合而抑制其药物外排作用。GQ与miR-451能协同逆转乳腺癌MCF-7/adr细胞对阿霉素的耐药，增强阿霉素的抗肿瘤作用。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 miRNA对MCF-7／adr细胞的耐药逆转作用及机制

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1．miRNA对MCF-7／adr的耐药逆转作用

2．miRNA对MCF-7／adr的耐药逆转机制

讨论

本章小结

第二部分 miRNA与GQ联合应用对MCF-7／adr细胞的耐药逆转作用及机制

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1．miRNA联合GQ对MCF-7／adr的耐药逆转作用

2．miRNA联合GQ逆转MCF-7／adr耐药机制

3．GQ逆转耐药的作用机制

讨论

本章小结

第三部分 miRNA与GQ联合应用的体内耐药逆转作用及机制

材料与方法

1．实验材料

2．实验动物

3．实验方法

结果

2．miR-451联合GQ增强阿霉素的体内抑瘤作用机制

讨论

本章小结

结论

参考文献

综述 miRNA逆转乳腺癌多药耐荮I生的研究进展

附录

致谢