口服微囊化卵黄免疫球蛋白（IgY）的制备及性能研究

摘要

口服特异性卵黄免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin，IgY)可治疗由细菌或病毒引起的肠道疾病，具有安全无残留、不产生抗药性、服用简便等优点，是一种具有广阔应用前景的抗生素替代品。但IgY在高强度的胃酸环境中易被胃蛋白酶降解，失去抗体活性。因此，如何避免IgY在胃中失活，而在小肠中稳定地发挥作用，是一个亟待解决的问题。针对这一问题，本论文采用微囊化技术包埋IgY，制备口服型IgY-壳聚糖-海藻酸钠微囊，从体外、体内两方面评价壳聚糖.海藻酸钠微囊作为IgY口服载体的可行性。 本研究以引起仔猪腹泻的最主要致病菌--产肠毒素大肠杆菌K88为抗原，免疫蛋鸡后获得特异性IgY。通过对获得高效价特异性IgY的最佳抗原浓度研究发现，K88菌毛蛋白对蛋鸡的免疫原性优于全菌；纯化的菌毛蛋白对蛋鸡的免疫原性优于粗菌毛蛋白，其诱导的抗体效价最高可达1:480000；确定菌毛蛋白的最佳浓度为2 mg/ml，全菌的最佳浓度为1010 mg/ml。 通过对IgY的分离纯化条件研究发现，盐析法提取IgY的最佳条件是将粗提的IgY经50％饱和度的硫酸铵盐析一次，再经14％(w/v)硫酸钠盐析一次，获得的IgY回收率可达46％，纯度可达77％；经超滤(100 kDa)后，最终获得的IgY冻干粉纯度为82％。 对IgY稳定性的研究结果表明，温度不超过70℃时，IgY具有良好的热稳定性；pH<3时，IgY活性大部分丧失：IgY对胰蛋白酶有较好的抵抗力，但低pH条件下对胃蛋白酶十分敏感；冷冻干燥处理对IgY活性有不利的影响；-20℃和4℃环境中，IgY冻干粉具有良好的贮藏稳定性。 为保护IgY的口服活性，选用天然材料海藻酸钠和壳聚糖作为壁材，利用气体吹喷制囊法，制备IgY-壳聚糖.海藻酸钠微囊。考察了成囊装置主要的物理条件对空白壳聚糖.海藻酸钠微囊粒径及形态的影响，确定制备微囊的最佳物理条件为：空气压力0.3 m3/h，液面距8 cm，恒流泵速度4 ml/min，搅拌子转速200 r/min。此条件下制备的新鲜微囊球形圆整，平均粒径约1 mm，且粒径分布集中。在此基础上，探讨了主要反应条件对微囊的载药量、包封率、保护IgY在模拟胃液中的稳定性、以及微囊在体外的释放行为的影响。确定制备微囊的优化条件为：成囊溶液pH 3.5，壳聚糖浓度0.2％(w/v)，CaCl2浓度0.5％(w/v)，海藻酸钠浓度2％(w/v)，药载比25％，在此优化条件下制备的IgY微囊载药量高于20％，包封率高于75％，IgY在模拟胃液中2 h累积释放率小于lO％，而在模拟肠液中4 h累积释放率大于80％。另外，ELISA和SDS-PAGE结果显示，IgY微囊在模拟胃液中可抵抗胃蛋白酶的降解，而且抗体的活性保持在70％以上。 将IgY-壳聚糖.海藻酸钠微囊用于断奶仔猪的攻毒治疗试验，结果表明，腹泻断奶仔猪服用IgY微囊后，病情很快得到控制，1 d后所有病猪得到治愈，而且体重增加最快；而未包埋的IgY冻干粉治疗效果低于微囊化IgY，3 d后所有病猪得到治愈。而对照组仔猪口服生理盐水，第1 d有腹泻症状的仔猪3 d后仍未见好转，体重下降。由此可见，IgY经壳聚糖.海藻酸钠微囊包埋后，可以很好的保护其在胃酸环境中的抗体活性，并且可于小肠中定点释放，能有效治愈断奶仔猪腹泻。 综上，本研究制备的IgY微囊，可保证IgY以较高的活性到达小肠，并在肠道中定点释放，稳定的发挥作用。其作为一种新型的口服动物保健产品，将具有良好的产业化前景。本研究也为其他口服生物活性物质的控释制剂开发奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

声明

引 言

1文献综述

1.1 IgY的研究进展

1.1.1 IgY的结构及功能

1.1.2 IgY的性质

1.1.3 IgY分离纯化方法的研究进展

1.1.4 IgY应用的研究进展

1.1.5保护IgY口服活性的研究进展

1.2壳聚糖-海藻酸钠生物微囊的研究进展

1.2.1微囊化技术概况

1.2.2壳聚糖与海藻酸钠

1.2.3壳聚糖和海藻酸钠反应微囊化原理

1.2.4壳聚糖-海藻酸钠微囊的制备方法

1.2.5壳聚糖-海藻酸钠生物微囊的应用研究进展

1.3本论文的研究意义和主要工作

参考文献

2抗产肠毒素大肠杆菌K88的特异性IgY的制备

2.1前言

2.2实验材料及设备

2.2.1实验动物

2.2.2菌种

2.2.3试剂

2.2.4仪器

2.2.5溶液配置

2.3实验方法

2.3.1细菌培养及菌毛的制备、纯化

2.3.2免疫原的制备

2.3.3蛋鸡的免疫

2.3.4鸡蛋的收集及水溶性组分的提取

2.3.5间接ELISA法检测特异性IgY抗体效价的建立

2.3.6蛋白质含量的测定

2.3.7菌毛蛋白纯度的测定

2.4结果与分析

2.4.1菌毛的纯化

2.4.2棋盘滴定法确定抗原包被量

2.4.3不同浓度的菌毛蛋白对蛋鸡的免疫效果

2.4.4不同浓度的全菌对蛋鸡的免疫效果

2.4.5茵毛蛋白与全菌对蛋鸡免疫效果的比较

2.5讨论

2.6小结

参考文献

3 IgY的分离、纯化及稳定性研究

3.1前言

3.2实验材料及设备

3.2.1实验材料

3.2.2试剂

3.2.3仪器

3.2.4溶液配置

3.3实验方法

3.3.1 IgY分离、纯化的工艺路线

3.3.2 IgY含量测定

3.3.3 IgY回收率及纯度测定

3.3.4 IgY活性检测

3.3.5热处理

3.3.6不同酸度处理

3.3.7胃蛋白酶处理

3.3.8胰蛋白酶处理

3.3.9 IgY的冷冻干燥稳定性

3.3.10 IgY的贮藏稳定性

3.4结果与分析

3.4.1 (NH4)2S04盐析条件的优化

3.4.2 Na2SO4盐析条件的优化

3.4.3 IgY的分离及纯化

3.4.5 IgY的热稳定性

3.4.6 IgY的酸稳定性

3.4.7 IgY对胃蛋白酶的稳定性

3.4.8 IgY对胰蛋白酶的稳定性

3.4.9 IgY的冷冻干燥稳定性

3.4.10 IgY的贮藏稳定性

3.5讨论

3.6小结

参考文献

4 IgY微囊的制备及性能表征

4.1前言

4.2实验材料及设备

4.2.1实验材料

4.2.2试剂

4.2.3仪器

4.2.4溶液配置

4.3实验方法

4.3.1空白壳聚糖-海藻酸钠微囊的制备、粒径分布及形态学研究

4.3.2 IgY微囊的制备、粒径分布及形态学研究

4.3.3 IgY微囊性能检测

4.3.4数据处理

4.4结果与分析

4.4.1物理条件对空白微囊粒径及形态学的影响

4.4.2成囊溶液的pH对微囊性能的影响

4.4.3壳聚糖浓度对微囊性能的影响

4.4.4 CaCl2浓度对微囊性能的影响

4.4.5海藻酸钠浓度对微囊性能的影响

4.4.6药载比对微囊性能的影响

4.4.7微囊体外释放形貌观察

4.5讨论

4.5.1成囊溶液的pH对微囊性能的影响

4.5.2壳聚糖浓度对微囊性能的影响

4.5.3 CaCl2浓度对微囊性能的影响

4.5.4海藻酸钠浓度对微囊性能的影响

4.5.5药载比对微囊性能的影响

4.6 小结

参考文献

5 IgY微囊对攻毒仔猪的治疗试验

5.1前言

5.2实验材料及设备

5.2.1试验动物

5.2.2菌种

5.2.3实验材料

5.2.4试剂

5.2.5仪器

5.2.6溶液配置

5.3实验方法

5.3.1细菌培养

5.3.2 IgY微囊的制备

5.3.3仔猪攻毒及治疗试验

5.3.4效果判定

5.3.5 ETEC K88浓度检测

5.4结果与分析

5.4.1临床观察

5.4.2直肠拭子中ETEC K88浓度变化

5.4.3胃及小肠pH值

5.5讨论

5.6小结

参考文献

6结论与展望

6.1结论

6.2展望

创新点摘要

附录A 成囊系统装置图

攻读博士学位期间发表学术论文情况

致 谢