典型全氟/多氟磺酸化合物对大鼠长时程增强的影响和机制研究

摘要

全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)是一种最典型的全氟磺酸化合物，由于良好的表面活性和稳定性被广泛应用于日常生活和工业生产等多个领域。PFOS能够通过血脑屏障对发育神经系统造成影响，抑制仔鼠学习记忆能力，但其机制尚不清楚。自2009年PFOS被列入斯德哥尔摩公约，已在多国禁止生产使用，但在某些生产领域仍在持续使用，包括直接向环境中排放的泡沫灭火剂和杀虫剂。此外，PFOS替代品生产应用的快速发展，使得大量短碳链及插入氮、氧等杂原子的全氟/多氟磺酸类化合物的环境水平升高，然而相关的毒理学研究极其有限，环境健康风险未知。研究典型全氟/多氟磺酸化合物的神经毒性效应和机制，对于阐明这类污染物与学习能力损伤、神经退行性疾病之间的关系具有重要意义。
　　本论文利用整体动物建立交叉哺育模型进行发育期暴露，研究PFOS对反映学习记忆能力的关键指标长时程增强(LTP)的影响，结合原代海马神经元细胞离体培养，从α-氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)受体运输调控探讨PFOS暴露引起LTP损伤的潜在机制。进一步对与学习记忆能力密切相关的Tau磷酸化和β淀粉样蛋白(Aβ)生成过程进行检测，阐明发育期PFOS暴露与神经退行性疾病的可能关联。最后，比较急性侧脑室暴露典型全氟/多氟磺酸化合物对在体LTP的影响，初步评价其神经毒性潜能。主要内容包括:
　　(1)建立整体动物交叉哺育模型，利用电生理技术测定PFOS对大鼠海马CA1区在体LTP的影响，阐明发育期PFOS暴露损伤学习记忆能力的机制。结果显示:发育期PFOS暴露会剂量依赖性抑制LTP的诱发和维持，与PFOS影响大鼠自发行为和损伤学习记忆能力的结果一致，为PFOS的发育神经毒性提供了电生理学依据。高频刺激60min后5mg/L和15mg/L PFOS暴露组的场突触后电位(field-excitatory postsynaptic potential，fEPSP)幅值与对照组相比降低20-27％。反映基础突触传递能力的输入输出曲线(I/O)刺激强度在0.3-0.5mA时PFOS处理组fEPSP幅值比对照组显著降低，双脉冲易化效应(PPF)在最大易化点TT15组显著低于对照组。结果提示PFOS发育期暴露会同时影响突触前细胞和突触后细胞的突触传递效率和突触可塑性，是PFOS损伤学习记忆能力的重要机制。
　　(2)结合体内实验和体外实验，阐明PFOS损伤LTP的AMPA调控机制。PFOS发育期体内暴露引起GluR1和GluR2蛋白和基因的表达水平下调，同时引起磷酸化蛋白GluR1-s831和蛋白激酶CaMKⅡ-α表达水平下调。新生仔鼠原代海马神经元细胞暴露于2μM和20μM PFOS后，AMPA受体亚基GluR1和GluR2在膜上的表达降低，与体内实验结果一致。PFOS引起谷氨酸作用蛋白GRIP1表达显著下调，与GluR2变化趋势一致，RNA剪辑酶ADAR2mRNA表达比对照组增加2倍。NBQX抑制PFOS对细胞钙稳态和相关基因表达的影响。结果说明PFOS通过改变AMPA受体亚基的表达调节AMPA受体的动态分布，提高AMPA受体对Ca2+的通透性，损伤神经突触可塑性。
　　(3)通过考察PFOS发育期暴露对Tau磷酸化和Aβ聚集水平的影响，阐明PFOS发育期暴露与神经退行性疾病之间的可能关联。结果发现:PFOS发育期暴露引起Tau总蛋白及mRNA表达水平上调，引起Tau蛋白在S199、T231、S396位点的磷酸化水平升高以及蛋白激酶GSK-3β蛋白含量显著上调。PFOS发育期暴露促进淀粉样蛋白前体App mRNA的表达上调，Aβ1-42表达增加，早老素Ps-1表达下调，引起App剪切过程异常和Aβ聚集。另外，PFOS血清浓度较低的出生前PFOS暴露组和出生后暴露组及出生前后均暴露组对Tau磷酸化和Aβ聚集水平的影响程度相当，提示胚胎期PFOS暴露具有较高的发育神经毒性。
　　(4)比较典型全氟/多氟磺酸类化合物急性侧脑室注射对在体LTP的影响，研究PFOS替代物的潜在神经毒性效应和机制。结果表明，PFOS替代物均对LTP产生抑制作用，并随暴露浓度升高抑制作用增强。高频刺激后60 min，对照组fEPSP幅值仍维持在基线的140％以上，而100μM PFOS、全氟己烷磺酸(PFHxS)和氯代多氟醚基磺酸(C1-PFAES)的fEPSP幅值降低至基线的97％和98％，显著低于对照组。全氟丁烷磺酸钾盐(PFBS)对LTP的抑制作用较弱，fEPSP幅值维持在基线的122％，与对照组无显著差异。PFHxS和C1-PFAES对LTP的损伤程度与PFOS相近，提示PFHxS和C1-PFAES具有与PFOS相当的损伤神经突触可塑性的潜能。C1-PFAES对基础波fEPSP有显著的抑制作用，提示C1-PFAES可能具有与全氟磺酸类化合物不同的神经毒性作用机制。因此有必要进一步研究PFOS替代物的发育神经毒性。
　　发育期PFOS暴露抑制LTP的诱导和维持，AMPA受体调控是其重要机制。PFOS通过抑制蛋白激酶CaMKⅡ-α对GluR1-s831、GluR2-s880的磷酸化，改变AMPA受体亚基GluR1、GluR2在细胞膜上的分布，引起AMPA受体内化，增强AMPA受体对钙离子的通透性。同时PFOS发育期暴露引起Tau磷酸化水平上调及Aβ聚集也提示PFOS发育期暴露与神经退行性疾病的可能关联。初步发现PFOS替代物的神经毒性潜能，提示有必要进一步研究其发育神经毒性效应和机制。研究结果为全氟/多氟化合物的人体健康风险评价提供科学依据。

目录

声明

摘要

主要中英文缩略表

1 绪论

1．1 全氟辛烷磺酸(PFOS)概述

1．1．1 PFOS的理化性质和应用

1．1．2 PFOS的环境污染现状

1．1．3 PFOS在野生动物体内的生物累积

1．1．4 PFOS的毒性效应

1．1．5 PFOS的发育神经毒性效应

1．1．6 PFOS的发育神经毒性机制

1．1．7 PFOS的人群暴露和环境流行病学调查结果

1．1．8 PFOS替代物的发展

1．2 学习记忆能力形成的相关机制

1．2．1 海马的学习记忆功能

1．2．2 突触可塑性与学习记忆

1．2．3 AMPA受体与学习记忆

1．2．4 钙稳态与学习记忆

1．3 神经退行性疾病与环境污染物暴露的关联

1．4 本文主要研究思路与内容

1．4．1 选题依据

1．4．2 研究目的和内容

1．4．3 研究意义

2 PFOS发育期暴露对大鼠LTP及AMPA分布的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 主要试剂和仪器

2．1．2 实验动物及染毒

2．1．3 血清及海马组织的收集

2．1．4 血清中PFOS舍量的测定

2．1．5 旷场试验

2．1．6 电生理实验

2．1．7 膜蛋白的提取

2．1．8 总蛋白的提取

2．1．9 蛋白浓度测定

2．1．10 Western blot检测AMPA受体蛋白的分布水平

2．1．11 荧光定量PCR检测海马中AMPA受体相关基因的表达

2．1．12 数据统计分析

2．2 结果与讨论

2．2．1 血清中PFOS的含量

2．2．2 PFOS暴露对大鼠自发行为的影响

2．2．3 PFOS发育期暴露对LTP的影响

2．2．4 PFOS发育期暴露对I／O和PPF的影响

2．2．5 PFOS发育期暴露对AMPA受体亚基表达的影响

2．2．6 PFOS发育期暴露对AMPA受体亚基磷酸化的影响

2．3 本章小结

3 PFOS暴露干扰大鼠原代海马神经元钙稳态的AMPA调控机制

3．1 材料与方法

3．1．1 主要试剂和仪器

3．1．2 主要实验试剂配制

3．1．3 原代海马神经元培养和鉴定

3．1．4 原代海马神经元细胞存活率实验

3．1．5 原代海马神经元凋亡实验

3．1．6 原代海马神经元细胞钙成像实验

3．1．7 荧光定量PCR检测相关基因表达水平

3．1．8 数据统计分析

3．2 结果与讨论

3．2．1 原代海马神经元细胞培养与鉴定

3．2．2 PFOS对原代海马神经元细胞活性的影响

3．2．3 PFOS对原代海马神经元细胞凋亡的影响

3．2．4 原代海马神经元细胞钙成像实验

3．2．5 PFOS对原代海马神经元AMPA受体相关基因表达的影响

3．3 本章小结

4 PFOS发育期暴露对Tau磷酸化和Aβ聚集的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 主要试剂和仪器

4．1．2 实验动物及染毒

4．1．3 ELISA检测海马中Aβ1-42和GSK-3β蛋白表达水平

4．1．4 Western blot检测海马中凋亡相关蛋白表达水平

4．1．5 荧光定量PCR检测相关基因表达水平

4．1．6 数据统计分析

4．2 结果与讨论

4．2．1 PFOS暴露对Tau蛋白和基因表达的影响

4．2．2 PFOS暴露对Tau磷酸化的影响

4．2．3 PFOS对Aβ1-42聚集的影响

4．3 本章小结

5 PFOS替代物对大鼠在体LTP的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 实验动物

5．1．2 试剂与仪器

5．1．3 电生理实验

5．1．4 数据统计分析

5．2 结果与讨论

5．2．1 PFOS及其替代物对基础fEPSP的影响

5．2．2 PFOS及其替代物对I／O的影响

5．2．3 PFOS及其替代物对PPF的影响

5．2．4 PFOS及其替代物对大鼠在体LTP的影响

5．3 本章小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

附录

作者简介

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢