石竹和拟南芥试管苗玻璃化机制及控制研究

摘要

玻璃化是植物组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变，普遍发生于多种植物中。玻璃化试管苗呈透明或半透明的水浸状，叶片卷曲畸形，分化及存活能力低，无法进行继代培养及驯化移栽，给种苗商业化生产造成了严重的经济损失，也限制了组织培养技术在种质资源保存及基因工程育种中的应用。目前，对玻璃化发生的机制尚没有统一的认识，系统研究玻璃化发生发展的机制并开发有效的防控措施对于组织培养技术的良性发展具有重要的理论及实践意义。本论文以石竹和拟南芥为对象，分析了玻璃化苗显微结构及生理生化特征，并构建了拟南芥玻璃化苗基因组甲基化数据库及转录组数据库，与正常苗进行了差异比较，同时系统研究了乙烯在玻璃化发生中的作用机制及AgNO3防控玻璃化的效应。主要结果如下: (1)利用扫描电镜和透射电镜对正常苗和玻璃化苗组织及细胞结构进行了观察，发现玻璃化苗茎、叶显微和亚显微结构发生明显改变。玻璃化苗细胞壁变薄，膜结构受损，细胞质稀薄，叶绿体及淀粉粒数量减少;导管管腔出现塌陷、堵塞;气孔在脱落酸、黑暗及脱水处理下均不能正常关闭。 (2)对玻璃化苗和正常苗水分及活性氧代谢相关指标进行了检测，结果表明，与正常苗相比，玻璃化苗自由水含量增加了21％，束缚水含量降低了18％，质外体水含量增加了6.5倍，质外体气体含量降低了89％;过氧化氢(H2O2)含量及氧阴离子自由基（O2·-）产生速率分别提高了2.2倍和3.1倍，多种抗氧化酶活性及抗氧化物质含量显著降低;丙二醛(MDA)含量及相对电导率分别增加了1.5倍及2.6倍。表明玻璃化苗水分及活性氧代谢异常，氧化平衡破坏，水分过度积累。 (3)利用全基因组甲基化测序技术构建了拟南芥玻璃化苗及正常苗的基因组甲基化数据库，分析了玻璃化苗基因组甲基化特点及与正常苗基因组甲基化的差异。玻璃化苗基因组CHH甲基化水平明显低于正常苗。共鉴定出4066个DNA甲基化水平发生变化的差异甲基化区域（Differentially Methylated Regions，DMRs），其中包括1016个高甲基化DMRs和3050个低甲基化DMRs;CHH序列中的DMRs数量显著高于CG和CHG序列中的DMRs数量;GO分析表明，CHH差异甲基化基因/启动子主要富集于胁迫响应、刺激（应激、化学物质和激素）响应和细胞代谢途径。表明CHH区域低甲基化引起的胁迫或刺激响应及代谢的改变是玻璃化的主要原因。 (4)构建了拟南芥玻璃化苗的转录组数据库，并与正常苗转录组进行了比较，共筛选到2197个差异表达基因，其中上调表达基因1212个，下调表达基因985个。Mapman分析发现，差异表达基因富集于乙烯、活性氧信号通路及细胞壁通路，并且多数呈上调表达。甲基化组和转录组联合分析结果表明，CHH甲基化水平与基因表达水平呈负相关。表明CHH低甲基化介导的乙烯和活性氧信号通路相关基因高表达可能是玻璃化发生发展的主要原因。 (5)在玻璃化诱导条件下，野生型拟南芥和脱落酸不敏感突变体均出现典型的玻璃化症状，而乙烯不敏感突变体和用乙烯作用抑制剂AgNO3培养的野生型均不发生玻璃化，说明乙烯是诱导玻璃化发生的关键因子。亚硫酸氢盐测序分析结果表明，玻璃化苗乙烯合成酶基因ACS1和乙烯受体基因ETR1启动子甲基化水平明显低于正常苗，ACS1和ETR1基因表达量显著高于正常苗，而培养基中添加AgNO3可提高ACS1和ETR1基因启动子DNA甲基化水平，降低基因表达。同时，玻璃化苗内源乙烯含量增加，气孔开度减小，失水速率下降，水孔蛋白磷酸化水平升高，吸水能力增强，而AgNO3可降低玻璃化苗内源乙烯含量，增大气孔开度，提高失水速率，降低水孔蛋白磷酸化水平及吸水能力。表明，不适的组织培养条件可使乙烯合成及信号转导相关基因低甲基化，从而介导基因表达量增加，乙烯合成及信号转导增强，引起细胞失水减少、吸水增强，导致组织水分过度积累，玻璃化症状产生，而AgNO3可通过提高乙烯合成及信号转导相关基因甲基化水平抑制这一过程。 (6)培养基中添加30μmol/L AgNO3可使67％的石竹玻璃化苗恢复正常，并可使石竹玻璃化率从63.3％降低到2.67％。生理生化检测结果表明，AgNO3可降低石竹试管苗乙烯合成及乙烯信号转导相关基因的表达，降低内源性乙烯含量，增强抗氧化酶活性，减少保卫细胞中H2O2水平，增加叶片气孔开度和失水率，降低组织含水量。 综上所述，本研究阐明了DNA低甲基化介导的乙烯信号通路基因活化导致拟南芥玻璃化发生的机制及AgNO3抑制拟南芥玻璃化的作用与机制，同时用石竹验证了AgNO3控制玻璃化的作用，为全面揭示试管苗玻璃化发生机制及玻璃化的有效防治提供了重要的参考及指导。

目录

声明

摘要

图目录

表目录

主要符号表

1 绪论

1．1 植物组织培养玻璃化研究进展

1．1．2玻璃化试管苗的解剖结构及其生理生化变化

1．1．3影响玻璃化发生的因素

1．1．4玻璃化发生机制

1．1．5玻璃化的预防与恢复

1．2植物DNA甲基化研究进展

1．2．1 DNA甲基化的作用机制与基因表达调控

1．2．2 DNA甲基化的检测方法

1．2．3 DNA甲基化在植物应对逆境胁迫中的作用

1．3 乙烯信号转导及其在植物逆境响应中的作用

1．3．1乙烯的生理作用

1．3．2 乙烯的生物合成及其信号转导

1．3．3 乙烯在植物逆境响应中的作用

1．4研究工作主要思路

1．4．1立题依据

1．4．2研究内容

2石竹玻璃化试管苗的显微结构特征及生理生化变化

2．1 引言

2．2实验材料、试剂与仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验仪器

2．3实验方法

2．3．1 中国石竹的培养

2．3．2光学显微镜及透射电镜切片样品的制作和观察

2．3．3扫描电镜样品制作和观察

2．3．4叶片水分代谢相关指标测定

2．3．5叶绿索、可溶性蛋白和可溶性糖含量测定

2．3．6抗氧化酶活性检测

2．3．7活性氧含量测定

2．3．8相对电导率测定

2．3．9丙二醛含量测定

2．3．10抗坏血酸和脱氢抗坏血酸含量测定

2．3．11氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽含量测定

2．3．12数据分析

2．4实验结果

2．4．1 玻璃化试管苗的形态特征

2．4．2玻璃化苗茎、叶扫描结构特征

2．4．3玻璃化试管苗细胞显微结构特征

2．4．4玻璃化试管苗叶肉细胞亚显微结构特征

2．4．5玻璃化试管苗气孔运动特征

2．4．6玻璃化试管苗的水分及质外体气体含量变化

2．4．7玻璃化试管苗可溶性糖、可溶性蛋白及叶绿素含量的变化

2．4．8玻璃化试管苗活性氧代谢变化

2．5讨论

2．6本章小结

3 拟南芥玻璃化试管苗的DNA甲基化及转录组变化

3．1 引言

3．2实验材料、试剂与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2实验试剂

3．2．3实验仪器

3．3实验方法

3．3．1拟南芥玻璃化苗的诱导及培养

3．3．2 DNA样品检测与文库构建

3．3．3参考序列比对分析

3．3．4差异甲基化分析

3．3．5 RNA提取及转录组测序

3．3．6甲_基化测序与转录组测序关联分析

3．4实验结果

3．4．1 拟南芥玻璃化苗的诱导及形态观察

3．4．2拟南芥玻璃化苗全基因组甲基化水平及类型变化

3．4．3拟南芥玻璃化苗与正常苗甲基化差异分析

3．4．4拟南芥玻璃化苗转录组测序及分析

3．4．5拟南芥玻璃化苗转录组测序与全基因组甲基化测序联合分析

3．5讨论

3．6本章小结

4 乙烯在拟南芥玻璃化发生中的作用机制

4．1 引言

4．2实验材料、试剂与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2实验试剂

4．2．3 实验仪器

4．3实验方法

4．3．1 拟南芥试管苗的培养

4．3．2激素含量的测定

4．3．3亚硫酸盐测序法

4．3．4实时定量荧光PCR

4．3．5保卫细胞中活性氧含量及气孔开度测定

4．3．6叶片失水速率及组织含水量测定

4．3．7水孔蛋白磷酸化的Western blot鉴定

4．3．8原生质体吸水膨胀实验

4．4实验结果

4．4．1 结冷胶对拟南芥乙烯受体突变体的影响

4．4．2 AgNO3对拟南芥试管苗玻璃化的影响

4．4．4玻璃化苗ACS1和ETR1基因甲基化的变化及AgNO3对其影响

4．4．5玻璃化苗乙烯合成及信号转导相关基因表达的变化及AgNO3对其影响

4．4．6玻璃化苗气孔运动和气孔开度的变化及AgNO3对其影响

4．4．7玻璃化苗水孔蛋白磷酸化的变化及AgNO3对其影响

4．5讨论

4．6本章小结

5 AgNO3控制石竹玻璃化发生的作用及机制

5．1 引言

5．2实验材料、试剂与仪器

5．2．1 实验材料

5．2．2实验试剂

5．2．3实验仪器

5．3实验方法

5．3．1 石竹玻璃化苗诱导及玻璃化恢复

5．3．2乙烯含量测定

5．3．3实时定量荧光PCR

5．3．4保卫细胞中活性氧含量及气孔开度测定

5．3．5叶片失水速率及组织含水量测定

5．4结果与分析

5．4．1 AgNO3对中国石竹玻璃化苗的抑制及恢复作用

5．4．2 AgNO3对中国石竹玻璃化苗乙烯积累及乙烯信号相关基因表达的影响

5．4．3 AgNO3对中国石竹玻璃化苗抗氧化酶的影响

5．4．4 AgNO3对中国石竹玻璃化苗活性氧积累的影响

5．4．5 AgNO3对中国石竹玻璃化苗保卫细胞中活性氧和气孔开度的影响

5．4．6 AgNO3对中国石竹玻璃化苗失水率和含水量的影响

5．5 讨论

5．6本章小结

6结论、创新点与展望

6．1 结论

6．2创新点

6．3 展望

参考文献

附录

作者简介

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢