生物体内可降解的聚乙烯亚胺类基因载体的设计与应用

摘要

基因治疗作为一种靶向性强、低毒的新型治疗疾病的手段，在医学领域中表现出巨大的应用前景。阳离子聚合物由于具有免疫原性低、结构可控、转染效率较高等优点，成为基因载体领域的研究热点。但其作为基因载体的转染效率和细胞毒性之间存在着逆相关性，一直是严重限制基因递送效率的巨大障碍。这主要归因于阳离子聚合物的分子量，分子量越大，正电荷密度越高，聚合物表现出增强的转染效率以及相应较高的细胞毒性。聚乙烯亚胺（PEI）作为典型的阳离子聚合物载体，存在的高细胞毒性限制了其在基因递送领域中的进一步应用。为了解决这一关键问题，设计开发了可降解的高分子量PEI聚合物，该聚合物可以有效包载DNA以进行细胞内吞，并可以响应肿瘤处的微环境，实现聚合物的降解以及DNA的释放。论文研究工作主要如下： （1）为了使高分子量PEI聚合物具有可降解性，选择具有不同的响应降解性单体作为聚合单体。设计合成了分别具有酸敏感的酯基、具有活性氧（ROS）敏感的缩硫酮基团的二烯类单体。 （2）通过分子量为600的聚乙烯亚胺（PEI600）和二烯类单体的迈克尔加成聚合制备了两种可降解的PEI聚合物。PEI聚合物可以有效地包载DNA，形成具有180nm左右尺寸的纳米复合物。与商业上可获得的转染试剂，分子量为25k的聚乙烯亚胺（PEI25k）相比，可降解的PEI聚合物表现出增强的基因递送效率，体内转染效率提高近3倍。而通过酸性环境或高活性氧环境（ROS）促进聚合物的快速降解导致DNA的细胞内释放，可以极大地降低聚合物的细胞毒性，细胞存活率从60%提高到90%以上。特别在肿瘤细胞中，ROS特异响应性PEI聚合物也显示出其潜在的应用，表现出增强的体内基因表达水平。因此，我们的研究可以有效地平衡阳离子聚合物的转染效率和细胞毒性之间的关系，从而提供对非病毒基因递送载体的合理设计的有效思路。

目录

声明

引言

1 文献综述

1.1 基因治疗

1.2 基因载体

1.2.1 病毒类基因载体

1.2.2 非病毒类基因载体

1.3 基因传递过程的屏障

1.4 基于肿瘤微环境的响应性纳米载体

1.4.1 ROS响应型纳米载体

1.4.2 pH响应型纳米载体

1.4.3 还原响应型纳米载体

1.5 聚乙烯亚胺

1.5.1 低分子量PEI的修饰与改性

1.5.2 PEI在基因递送领域中的应用

1.6 论文设计

2 实验部分

2.1 实验材料

2.2 实验仪器

2.3 双丙烯类单体的合成与表征

（1）己烷-1,6-二基二丙烯酸酯单体（化合物A）的合成

（2）N,N’-（（丙烷-2,2-二基双（硫））双（乙烷-2,1-二基））二丙烯酰胺（化合物B）的合成

（3）N，N'- （丁烷-1,4-二基）二丙烯酰胺（化合物C）的合成

2.4 高分子量PEI的合成与表征

2.5 高分子量PEI的响应性降解

2.6 高分子量PEI/DNA复合物的制备

2.7 粒径与Zeta电位实验

2.8 琼脂糖凝胶电泳实验

2.9 溴化乙锭（EB）排阻实验

2.10 体外转染

2.11 细胞内吞与胞内分布

2.12 H-PEI及H-PEI响应性降解后的细胞毒性

2.13 体内转染

2.14 基于PEI改性的polyDCPD的共聚物的制备

2.15 polyDCPD的共聚物/H-PEI-B的生物相容性表征

3 结果与讨论

3.1 双丙烯类单体的合成及核磁表征

3.2 高分子量PEI的合成及核磁表征

3.3 H-PEI在酸性及ROS下的响应性降解

3.4 H-PEI/DNA纳米复合物的制备及包载DNA能力

3.5 H-PEI/DNA复合物在酸性及ROS下的DNA解离能力

3.6 体外转染

3.7 细胞内吞

3.8 细胞毒性

3.9 体内转染

3.10 基于polyDCPD的共聚物的动态力学性能

3.11OXDBMI/polyDCPD (20%)共聚物/H-PEI-B的生物相容性

结论

参 考 文 献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

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