船舶压载水处理品质的简单快速微流控评价方法与系统研究

摘要

根据“国际控制和管理船舶压载水和沉积物公约”颁布的D-2标准，船舶压载水可以采用化学，物理学，机械或电气方法进行处理。但是现有的处理方法面临许多技术方面的挑战。
　　一方面，现在常用的方法大都需要使用昂贵的、大体积的检测设备，需要大量的检测样本，耗时耗力，操作复杂。另一方面，目前的压载水质量分析方法严重依赖陆基实验室的显微镜或其他劳动密集型方法，耗时耗力。如果实验室分析的结果没有发现任何危险的微生物，那么所有费用将由检查员支付。显然，船东和港务局都需要一种更便宜，更快速的分析方式，更有效的检查系统。微流控技术以其分析速度快，消耗样品少，成本低，操作简单等优点，可以作为一种有效的解决方案。
　　本文提出了基于微流控技术的船舶压载水消杀处理和质量检测方法。
　　首先，本文介绍了一种有效的结合动电学方法的微流体装置，用于评估压载水处理效率以及确定采用化学方法进行压载水处理时的最佳参数。本文通过检测用次氯酸钠(NaClO)溶液处理天然海水中的杜氏盐藻（D.salina）类的消杀效果来评估该系统的性能。系统采用电渗透和电泳的方法的控制微通道中样品的流动，利用激光诱导叶绿素荧光(LICF)方法测定系统中藻类细胞的活性，该系统可以在亚毫米尺度下自动运行，通过在显示屏上快速响应的叶绿素荧光强度信号的强度来显示微藻的消杀效果，每个处理条件下仅需要40μl的样品。本文采用两组主要的测试集，第一组检测在不同浓度的试剂下微藻的活性，第二组在一定的化学试剂浓度下检查了不同处理时间下微藻的活性。结果表明，可以本系统准确地测定不同处理条件下微藻细胞的活性。
　　其次，根据D-2标准中指标微生物的相关规定，本文采用微流控电阻脉冲传感器(MRPS)技术来评估船舶压载水中的细菌数量以及港口的非本地物种入侵风险。通道的设计采用喷射式设计，使得主通道中的细菌流动更加流畅，并避免了堵塞。本文将大肠杆菌和肠道球菌作为检测目标，以确定它们的特性和浓度。本系统在尺寸为20μm×10μm×8μm（长×宽×高）水平矩形微通道上逐个粒子进行检测和计数，平均流速为4.5μL/min，在15分钟内可以实时检测并计数30μl的样本。系统采用鞘流进行聚焦，没有使用外接泵。通过检测电解质溶液中细菌通过检测区域时电阻增加导致的瞬态脉冲信号高度来确定细菌的大小。芯片的结构设计增加了流体动力学的考虑，检测信噪比可以达到约5，靶向细菌既不需要标记也不需要提取DNA。该系统易维护，精度高，可靠性好。
　　虽然IMO标准中对两种尺度的存活水生物的数量进行了规定，但是D-2标准中并未提及10微米以下微生物的相关规定，这些也应该纳入考虑的范围，因为压载水中可能存在小于10微米的更高浓度的其它入侵生物物种和碎片，所以还应检查压载水管理系统对此类生物体的处理效果，更全面的评估压载水处理系统，以降低这类物种的传播风险。因此最后，本文的目标是同时多尺度检测和分析海水中不同的类群，由此来进行压载水质量评价。本文利用可更换的微流控芯片检测器对压载水进行质量分析。检测系统采用集成的微流控芯片技术、阻抗脉冲传感器和LED光诱导叶绿素荧光(LED-LICF)技术进行检测。本系统可以测量目标微生物的数量，大小，形状和体积，还可以测定叶绿素荧光强度，这是分析浮游植物活力的重要因素。本系统采用的目标样本是小球藻（Chlorella volutis），杜氏盐藻（Dunaliella salina），亚种扁藻（Platymonas subcordiformis），金藻（Chrysophytes），大肠杆菌（Escherichia coli）和肠道球菌（Enterococci）。整个检测和操作可以在几分钟内在线检测完成，只需要耗费微升体积的样品溶液。可以同时显示输出代表微藻类大小的阻抗脉冲幅值和代表微藻中叶绿素量的荧光强度信号。可以根据实际需要检测样本的尺寸来设计检测区域的尺寸，合适的尺寸设计可以提高检测的灵敏度同时可以避免通道堵塞。根据多次实验的结果，提出了三种检测区域的最佳尺寸:150μm(L)×80μm(B)×80μm(H)，用于检测20～50μm大小的微藻;80μm(L)×40μm(B)×40μm(H)，用于检测3～20μm大小的微藻;对于细菌及1μm颗粒和直至2μm微藻，最佳尺寸为20μm(L)×10μm(B)×8μm(H)。本系统不需要对待测样本进行生物标记，通过改变微流控芯片上微通道的尺寸，本系统可以进行更多尺度的在线实时监测。

目录

声明

摘要

ABSTRACT

CONTENTS

Chapter 1 Introduction

1．1 Background

1．1．1 The problems of ballast water and invasive species

1．1．2 Microalgae in ballast water

1．1．3 Bacteria in ballast water

1．1．4 Global response to ships ballast water issues

1．2 Motivations，objectives and hypothesis

1．3 Literature review of the detecting，testing，monitoring and analyzing methods for ships ballast water quality

1．3．1Adenosine triphosphate(ATP)

1．3．2 Fluorescein diacetate(FDA)

1．3．4 Flow cytometry Method

1．3．5 Microscopy method

1．3．6 Polymerase chain reaction(PCR)method

1．3．7 Other potential analyzing methods

1．4 Outlines of dissertation

Chapter 2 A novel electrokinetic microfluidic detector for evaluating the effectiveness of disinfection of microalgae in ships ballast water

2．1 Introduction

2．2 Preparation of sample solution

2．2．1 Dunaliella salina isolation

2．2．2 Titration of sodium hypochlorite solution(NaClO)

2．3 Microfluidic chip technology

2．3．1 Advantages of microfluidic chip compared to conventional technologies

2．3．2 Fabrication of microfluidic chip

2．4 Theoretical applications

2．4．1 Analysis of control by electroosmosis

2．4．2 Analysis of control by electrophoresis

2．4．3 Analysis of control by electrokinetic on a microfluidic chip

2．5 Chlorophyll fluorescence-based activity assay

2．5．1The choice of excitation and emission spectrums for chlorophyll fluorescence

2．5．2 Analysis of microalgae activity by chlorophyll fluorescence

2．6 A novel detection system

2．6．1 System structure

2．6．2 Working principle

2．6．3 Experimental procedures

2．7 Results and Discussion

2．7．1 Relative activity after different concentration on the same duration

2．7．2 Relative activity after different treatment time

2．7．3 Effect on D．salina through treatment with different concentration NaClO at the same time

2．7．4 Effect on D．salina activity through treatment at constant concentration of sodium hypochlorite solution with different durations

2．8 Conclusion

Chapter 3 An examination of the validity of MRPS method for the detection of label-free E．coli and Enterococci in ships ballast water

3．1Introduction

3．2 Sample preparations

3．2．2 Growing E．coli and Enterococci in agar plates

3．2．3 Culturing E．coli and Enterococci

3．2．4 Samples and spiking

3．3 Theoretical applications

3．3．1 Resistive pulse analysis

3．3．2 The increase in electrical resistance by particle size

3．3．3 The increase in electrical resistance by off-axis

3．4Microfluidic chip for detecting system

3．4．1 Design of a microfluidic chip

3．4．2 Microfluidic chip fabrication

3．5 Microfluidic resistive pulse sensor(MRPS)detection system

3．5．1 System structure

3．5．2 Experimental procedure and working principle of MRPS detection system

3．6 Results and Discussion

3．6．1 Effectiveness design results of MRPS system

3．6．2 Examining the validity of MRPS detection system

3．6．3 Detecting Escherichia Coli and Enterococci

3．6．4 A comparison of results between conceptual model and experimental outcomes

3．7 Conclusion

Chapter 4 A changeable lab-on-a-chip detector for marine nonindigenous microorganisms in ships ballast water

4．1 Introduction

4．2 Sample preparations

4．2．1 Samples solution of microalgae

4．2．2 Sample solution of bacteria

4．3 Theoretical applications of fluorescence

4．3．1Excitaion and emission spectra

4．3．2 Brightness

4．3．3 Signal linearity

4．3．4 Environmental effects

4．4 Materials for detecting system

4．4．1 Design of a microfluidic chip

4．4．2 Fabrication of the microfluidic chip

4．4．3 Fundamental materials for LED light induced fluorescence detection

4．4．4 Design of excitation light source part and fluorescence collector part

4．5 Changeable chip detector

4．5．1 Overall design of detecting system

4．5．2Mechanical structure of a detecting box

4．5．3 LED light induced chlorophyll fluorescence(LED-LICF)detection principle

4．5．4 Working procedures

4．6 Results and Discussions

4．6．1 Validity system tests with fluorescent particles

4．6．2 Viable microorganisms tests

4．6．3 Simultaneous microorganisms viable tests

4．6．4 Bacteria and non-IMO microorganisms tests

4．7 Conclusions

Chapter 5 Conclusions and Recommendations

5．1 Conclusions and discussions

5．2 Recommendations

References

List of Abbreviations

Academic Papers

Acknowledgements

Curriculum Vitae