D-氨基酸氧化酶基因的诱导表达及酶工程的研究

摘要

本文利用乳糖代替IPTG作为诱导剂，对含有D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pWY中的DAAO进行诱导表达。通过摇瓶发酵，初步研究了乳糖浓度、菌体浓度、诱导温度、诱导时间对DAAO表达的影响，结果表明：当菌浓OD<,600>达1.0左右、乳糖浓度为10g/L、28℃下诱导约6h，摇瓶发酵得到的DAAO酶活高达2400U/L。在5L自控式发酵罐上进行表达时，对其高密度发酵的诱导温度进行了进一步优化，分别在23℃、25℃、28℃、32℃和37℃下进行乳糖诱导表达，通过pH控制，葡萄糖消耗结束后，开始降温并分两次补加乳糖进行诱导，在28℃乳糖浓度1％诱导发酵约22h，酶活最高达3784.32U/L，菌浓(OD<,600>)达27.44。 并且利用本实验室自制的金属螯合载体EPI-30-ARG-IDA-Co<'2+>对这种带有6个组氨酸的重组D-氨基酸氧化酶(DAAO)进行一步分离纯化，其纯化倍数为10倍，酶活回收率达38.35％，SDS-PAGE显示为单一条带，纯酶液经环氧载体Eupergit C固定化处理后，其最适反应温度提高到40℃、最适反应pH向碱性偏移，固定化酶对温度和pH的稳定性提高，表观米氏常数增大。固定化酶活力回收达到42.44％。

目录

文摘

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论文说明:文中缩写

声明

第一章 绪论

1.1D-氨基酸氧化酶的研究进展

1.1.1D-氨基酸氧化酶的来源及其在自然界的分布

1.1.2D-氨基酸氧化酶的生理功能及生物学特性

1.1.3D-氨基酸氧化酶的结构特性

1.1.4D-氨基酸氧化酶的热稳定性和pH稳定性

1.1.5D-氨基酸氧化酶的催化机理

1.1.6D-氨基酸氧化酶的底物特异性

1.1.7三角酵母的D-氨基酸氧化酶

1.1.8D-氨基酸氧化酶的基因克隆和序列分析

1.2D-氨基酸氧化酶基因的表达

1.2.1大肠杆菌(gscherichia coli)

1.2.2斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)

1.3D-氨基酸氧化酶的应用

1.4展望

第二章 实验材料、仪器和方法

2.1实验材料

2.1.1菌种及培养基配方

2.1.2抗生素溶液的配制

2.1.3固定化材料

2.1.4化学药品

2.2仪器与设备

2.3分析方法

2.3.1菌体浓度的测定

2.3.2D-氨基酸氧化酶(DAAO)活力测定

2.3.3蛋白质浓度测定

第三章 D-氨基酸氧化酶基因的诱导表达条件优化

前言

3.1材料

3.2实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1重组质粒的gel图

3.3.2daao基因的PCR扩增

3.3.3正交实验结果分析

3.3.4乳糖诱导的单因素条件优化

3.4结论

第四章 D-氨基酸氧化酶基因工程菌高密度培养

前言

4.1材料与仪器

4.2实验方法

4.2.1菌种活化

4.2.2种子液

4.2.2发酵罐上工艺优化

4.3结果与讨论

4.3.1诱导温度为23℃下高密度发酵的菌浓和酶活

4.3.2诱导温度为25℃下高密度发酵的菌浓和酶活

4.3.3诱导温度为28℃下高密度发酵的菌浓和酶活

4.3.4诱导温度为32℃下高密度发酵的菌浓和酶活

4.3.5诱导温度为37℃下高密度发酵的菌浓和酶活

4.4结论

第五章 D-氨基酸氧化酶的分离纯化

前言

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果与讨论

5.2.1超声破壁最适时间的选择

5.2.2载体投入不同比例对酶与载体吸附效率的影响

5.2.3纯化D-氨基酸氧化酶SDS-PAGE图谱

5.3结论

第六章 D-氨基酸氧化酶的固定化研究

前言

6.1材料与方法

6.1.1材抖

6.1.2方法

6.2结果与讨论

6.2.1D-氨基酸氧化酶的固定化效率

6.2.2最适反应温度的确定

6.2.3pH对酶活力的影响

6.2.4固定化酶的热稳定性

6.2.5固定化酶的pH稳定性

6.2.6DAAO米氏常数的测定

6.3结论

第七章 论文总结

7.1论文创新点

7.2论文后续工作与展望

致谢

参考文献

攻读硕士期间的研究成果