褶纹冠蚌谷胱甘肽硫转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶基因的分子克隆、表达及功能鉴定

摘要

褶纹冠蚌(Cristaria plicata)作为我国重要的淡水育珠蚌之一,易受病原体感染而发生疾病,育珠能力产生了较大的影响,因此开展其分子免疫的研究具有重要意义。
　　 谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GSTs)是解毒系统中的Ⅱ相解毒酶,催化谷胱甘肽亲电子底物的附着,在保护机体免受自由基(ROS)毒害中起重要作用。利用RACE-PCR及同源克隆方法,克隆出褶纹冠蚌GST cDNA全长。通过与其他物种氨基酸序列比对发现,这个GST属于Pi型,具有谷胱甘肽结合位点(G位点)和外源底物结合位点(H位点)的高度保守序列。褶纹冠蚌piGSTcDNA全长816 bp,包括615 bp的开放阅读框编码205个氨基酸,5’端非编码区19 bp,3’端非编码区182 bp含加尾信号(AATAAA)及ployA尾。预测编码的蛋白分子量大小为23.4 kD,等电点为5.2。褶纹冠蚌piGST mRNA在血细胞、鳃、肝脏、闭壳肌和外套膜等组织中均大量表达,在肝脏中表达量最大。利用RT-PCR分析检测Cp-piGST基因在注射嗜水气单胞菌后0-48小时的表达,结果表明经注射嗜水气单胞菌后,各组织中Cp-piGST基因的表达增加,到12h后达到最大值,随后表达下降,至48h后恢复至原有水平。本文还将基因扩增产物和表达载体pET-30a及pET-32a经Kpn I、EcoRI双酶切之后,连接并构建重组表达质粒,将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中,加IPTG至终浓度浓度为1mmol／L,20℃诱导8 h,得到大量可溶性蛋白,用Ni2+亲和层析镍柱纯化。与pET30构建的重组质粒,其纯化蛋白的活性为2.396μmoL／min／mg,而与pET32构建的重组质粒,其纯化蛋白的活性为1.706μmoL／min／mg；重组质粒Cp-piGST的最适pH为8.0左右,最适温度为37℃左右,随着变性剂浓度的增加,重组质粒Cp-piGST的活性逐渐降低。
　　 谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)是抗氧化系统中的重要酶,能起到清除生物氧化过程中产生的活性氧(ROS),对细胞具有保护作用。利用RACE-PCR及同源克隆方法,克隆出褶纹冠蚌GPX cDNA全长。通过与其他物种氨基酸序列比对发现,它属于含硒类GPX,含有决定GPX基本功能和生化性质的保守氨基酸,即四个氨基酸残基Gln106,Trp179,Arg123,Arg195和三个茎环结构。褶纹冠蚌Se-GPX cDNA全长919 bp,包括696 bp的开放阅读框编码232个氨基酸,5’端非编码区68 bp,3’端非编码区155 bp含加尾信号(AATAAA)及ployA尾。第72个氨基酸是由TGA编码的硒代半胱氨酸。预测该蛋白分子量大小为26.4.kD,等电点为6.4。褶纹冠蚌Se-GPX mRNA在肝脏中表达量最大,在其他组织中表达量均很少。褶纹冠蚌Se-GPX基因组全长为6403 bp,包括两个内含子,分别为2130 bp,3354 bp。