解耦联蛋白2对线粒体氧化损伤诱导端粒依赖性衰老的干预和机制

摘要

目的:
　　本研究拟观察长期血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）衰老的影响和相关机制，并进一步探讨高表达UCP2对细胞衰老、凋亡的影响和相关机制，以揭示UCP2在端粒依赖性衰老的作用。
　　方法:
　　1、用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)，干预血清饥饿后的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)1周，并分为四组，①DMEM组;②AngⅡ（0.1μmol/L）组;③AngⅡ（1μmol/L）组;④AngⅡ（10μmol/L）组。流式细胞仪法检测活性氧，线粒体膜电位和凋亡率，通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测各组衰老细胞数量（光学显微镜观察），通过Western blot检测各组细胞的TERT、UCP2、c-myc，c-fos、p65、p53、Akt、p-Akt、ERK和p-ERK蛋白的表达情况。
　　2、为了观察PI3K/Akt信号通路在氧化诱导细胞衰老机制中的作用，用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)干预血清饥饿后的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)前，通过LY294002(PI3K/Akt抑制剂)来抑制细胞的PI3K/Akt信号通路，并根据LY294002浓度不同，将实验组分为六组，Ⅰ DMEM组;Ⅱ AngⅡ1μmol/L组;ⅢLY2940025μmol/L+ AngⅡ1μmol/L组;Ⅳ LY29400210μmol/L+ AngⅡ1μmol/L组;ⅤLY29400220μmol/L+ AngⅡ1mol/L组;Ⅵ LY29400230μmol/L+ AngⅡ1μmol/L组。通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测各组衰老细胞数量（光学显微镜观察）。通过Western blot检测各组细胞的TERT、UCP2、c-myc、c-fos、p65、p53、Akt、p-Akt、ERK和p-ERK蛋白的表达情况。
　　3、用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和拟高表达解耦联蛋白2(UCP2)作用的外源性解偶联剂CLCCP，干预血清饥饿后的HUVECs1周，将实验分组设为(1)DMEM组;(2)AngⅡ(1μmol/L)组;(3)CLCCP(10μmol/L)+ AngⅡ(1μmol/L)组;(4)AngⅡ（1μmol/L）+DMSO组。通过上述相同的方法检测各组活性氧、线粒体膜电位、凋亡率和衰老细胞水平。通过Western blot检测各组细胞的TERT、Akt、p-Akt、ERK和p-ERK蛋白的表达情况。
　　结果:
　　1、AngⅡ(10μmol/L)组，AngⅡ(1μmol/L),AngⅡ(0.1μmol/L)组，DMEM组在干预一周后检测ROS水平分别为1595±16.7、1312±14.3、1096±13.8、943±12.3（各组间比较P均＜0.01）;线粒体膜电位水平分别为948±13.2、826±11.8、652±9.9、298±6.1（各组间比较P均＜0.01）;各组凋亡率（Annexin V-FITC）分别为50.01±5.9、31.4±1.5、22.2±3.2、15.8±2.0(各组间比较P均＜0.01);β-半乳糖苷酶染色的衰老细胞随着AngⅡ浓度的升高而增多;随着AngⅡ浓度的增高，TERT、UCP2、P-erk、P-Akt、c-myc、c-fos、P53、P65的表达水平都有所升高，都要显著高于对照组，P65在高水平AngⅡ干预下表达明显升高。
　　2、随着PI3K/Akt抑制剂LY294002的浓度的升高，各组细胞染色情况我们可以看出，细胞数明显减少，染色衰老的细胞逐渐的减少;通过LY294002抑制PI3K/Akt通路后，p-Akt、TERT、UCP2、c-fos、p65、c-myc、p53的表达显著降低，在高浓度LY294002时AKt的表达量也有所降低， P-ERK的表达与LY294002浓度具有正相关性，且差异很显著。
　　3、线粒体解耦联组的ROS水平（1123±12.5）要低于AngⅡ组(1258±13.6，p＜0.01);线粒体解耦联组的膜电位水平（626±9.8）要低于AngⅡ组(835±12.2，p＜0.01);线粒体解耦联组的凋亡率（21.45±1.8）要低于AngⅡ组(32.2±1.6，p＜0.01);线粒体解耦联组通过β-半乳糖苷酶染色的衰老细胞要明显少于AngⅡ组;Western blot下，线粒体解耦联组相对于AngⅡ组，TERT、P-Akt，P-ERK的表达水平明显增加。
　　结论:
　　1、长期的氧化损伤下可以诱导细胞衰老和凋亡，外源性UCP2可以降低线粒体膜电位水平和ROS水平，抑制细胞的衰老和凋亡，其过程涉及PI3K/Akt信号通路，ERK信号通路和TERT的高活性。
　　2、依赖ROS的PI3K/AKt增殖信号促进细胞衰老。
　　3、ROS能激活PI3K/Akt和ERK信号途径通路，P65、c-myc、c-fos、TERT和UCP2位于PI3K/Akt通路作用的下游，它们可能是氧化损伤下抗衰老和凋亡的重要通路和生存因子。

目录

声明

摘要

缩略词对照表

第1章 引言

第2章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞株来源

2．1．2 主要实验仪器

2．1．3 主要实验试剂

2．1．4 自配试剂

2．2．1 人脐静脉内皮细胞培养

2．2．2 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的处理

2．2．3 检测指标与方法

2．3 统计学分析

第3章 实验结果

3．1 血管紧张素Ⅱ对线粒体活性氧和膜电位的影响

3．2 血管紧张素Ⅱ对凋亡率的影响

3．3 血管紧张素Ⅱ对细胞衰老的影响

3．4 血管紧张素Ⅱ对HUVEC中TERT、UCP2、ERK、AKt、p-ERK、p-Akt、c-myc、c-fos、p53、p65蛋白表达水平的影响

3．5 不同浓度PI3K／AKT抑制剂对HUVECs衰老细胞β-半乳糖苷酶的染色影响

3．6 不同浓度PI3K／AKT抑制剂对HUVECs中TERT、UCP2、ERK、AKt、p-ERK、p-Akt、c-myc、c-fos、p53、p65蛋白表达水平的影响

3．7 线粒体解耦联对血管紧张素Ⅱ处理下的HUVECs活性氧和膜电位的影响

3．8 线粒体解耦联对血管紧张素Ⅱ处理下的HUVECs凋亡率的影响

3．9 线粒体解耦联对血管紧张素Ⅱ处理下的衰老细胞β-半乳糖苷酶的染色影响

3．10 线粒体解耦联对TERT、ERK、AKt、p-ERK、p-Akt蛋白表达水平的影响

第4章 讨论

4．1 PI3K／AKT和ERK信号通路与细胞衰老

4．2 活性氧和p53对细胞衰老和凋亡的影响

4．3 PI3K／AKT和ERK信号通路与UCP2等生存因子在端粒依赖性衰老中作用

4．4 UCP2对端粒依赖性衰老的影响

4．5 UCP2在端粒依赖性衰老的作用机制

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述